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细胞培养:小鼠胚胎干细胞体外EB分化鉴定
作者: 来源: 2014-03-13

  实验概要

  本方法主要介绍小鼠胚胎干细胞体外EB分化鉴定流程。

  主要试剂

  高糖DMEM(Gibco,cat NO:12800-017粉末)、DMEM/F12(Gibco,cat NO:12500-062粉末)、胎牛血清(FBS)(Gibco,cat NO:16000044)

  非必需氨基酸(NEAA)(Gibco,cat NO:11140050)、胰酶0.25% (1X) with EDTA 4Na, liquid(Gibco,cat NO:25200072)、明胶(BD,cat NO:354277)、青链霉素(SP)(Gibco,cat NO:15140122)、L-谷氨酰胺(Gibco,cat NO:25030081)、血清替代物(Gibco,cat NO:10829028)

  10%FBS培养液(Gibco , cat NO.10099141)

  主要设备

  1、超净台

  2、CO2培养箱(Thermo , cat NO.3131)

  3、6cm培养皿(corning , cat NO.430166)、10cm培养皿(corning , cat NO.430167)

  4、15ml离心管(corning , cat NO.430791)、50ml离心管(corning , cat NO.430829)、冻存管(corning , cat NO.430659)

  5、正置显微镜

  实验步骤

  ①常规方法消化细胞,吹打时用粗口滴管,只吹打成细胞团块;

  ②将细胞团块移至6 cm或10 cm培养皿中,改用含10%FBS的培养液培养(每个6 cm培养皿加5 ml培养液);

  ③将培养皿放入37℃CO2培养箱培养,每天取出1-2次,轻轻晃动或用粗口滴管吹打,使细胞悬浮,各团分开,并逐日观察;

  ④一般培养第3天细胞团开始分层,外部是一层较大的内胚层样细胞,内部的细胞则小而紧密,为外胚层样细胞和干细胞,此为简单类胚;再培养5-10天,分层增多,并出现空腔,整个胚呈圆泡状,此为囊状胚。

  ⑤收集囊状胚,提取mRNA,反转录为cDNA,然后使用三胚层的引物进行PCR来检测三胚层的基因的表达情况,从而确定囊状胚中是否有三胚层的分化,这样可以确定细胞是否具有在体外分化为三胚层细胞的能力。