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最近做原核表达的几点教训和体会,与大家分享
作者: 来源:丁香园 2014-03-12

  

 

  最近在做原核表达,包涵体。以前也做过,但经验不多。从园子里也学到不少。一点失败的教训以及纯化过程中的体会,贴出来与大家共享,同时希望得到同行们的指正

 

  1. 首先介绍一下背景。载体是novagen公司的pET22b,Amp抗性。菌株是Invitrogen的BL21 star DE3,是一个蛋白降解酶突变菌株,也就是说是一种优化表达菌株。

  2. 第一次失败。第一次做诱导的时候,重复了很多次,但总是诱导不出来。PCR,酶切都正确。但没等测序结果出来就开始做了。失败了。曾在园子求助。后来证明是引物错误。我们实验室合成引物都要先发给purchasing office,然后才由他们与公司交涉。这个office的老太太把引物弄掉了一个碱基。

  教训:在实验过程中,再仔细都是不为过的。引物来了后管壁上贴有序列,但我忽略了。

  3. 第二次失败。后来重新构建,转化,诱导。第一次诱导时根本就没带。见附图(图片质量太差了,sorry,下面几个帖会逐渐好转。我们都在失败中提高,进步,不是吗

  

Smile

 

  )

  然后开始找闷头原因。周一下午5点我就接了DE3菌,由于那天人非常不舒服,去看医生了,等了很久,到第二天中午11点才转接!而且是按1:50转接的!也就是菌在转接之前培养了18 h!

  我们都知道,带Amp的E.coli在含Amp的平板上培养超过16 h后,菌周围会长出小菌落,我们叫它卫星菌落。这是因为细菌在生长的时候,为了抵抗Amp,会分泌B-内酰胺酶,而该酶会降解培养基中的Amp。对Amp产生抗性的机制和其他抗生素的情况是不同的(具体可以翻看分子克隆)。到菌体生长到足够浓度的时候,培养基的Amp就会慢慢减少。一旦细菌失去选择压力,就可能造成质粒丢失。当Amp降到很低,不足以抑制细菌生长时,未携带质粒的菌就会长得比带质粒的快。所以当培养时间足够长后,培养基中的B-内酰胺酶就会积累到很高的浓度。转接时(我是1:50转的),高浓度的酶可能破坏新鲜培养基中的Amp(而且我用的浓度是50 ug/ml)。这样,就造成最后收集的菌中,大部分都是没有带质粒的菌了。

  当然还有一个可能的原因就是死亡的菌体分泌一些降解酶,使得表达检测失败。

  这两种推测都只是推测,但我觉得第一种情况应该引起我们的重视。在使用Amp抗性的时候要格外注意。