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实验技能SOP:小鼠腹腔注射LD50的测定标准操作规程(SOP)
作者: 来源: 2014-08-08

  【目的】通过实验学习测定药物LD50的方法、步骤及计算过程,观察受试药品一次给予动物后所产生的急性毒性反应和死亡情况.

  【原理】药物给药剂量与动物死亡率间呈正态分布,以对数剂量为横坐标、死亡率为纵坐标作图,可得到一对称S型曲线,其两端较平坦,中间较陡,说明两端处剂量稍有变化时死亡率的改变不易表现出来,在50%死亡率处斜率最大,该处剂量稍有变动时,其死亡率变动最明显,即最灵敏,在技术上也最容易测得准确,所以人们常选用LD50值作为反映药物的指标.若将死亡率换算成机率单位,则对数剂量与机率单位呈直线关系,用数学方法可拟合其回归方程式,可精确地计算LD50及引起任何死亡率的剂量及相关数据.

  【器材】注射器(1ml)、天平、小鼠笼、苦味酸.

  【药品】盐酸普鲁卡因

  【动物】18~22g健康小鼠50只(正式试验),雌雄各半(雌鼠应无孕),实验前禁食12h,不禁水.

  【方法】

  1.预试验 目的是寻找引起0%和100%动物死亡的剂量范围,以便正式实验时确定各组剂量.一般是取小鼠9~12只,分3~4组,选择组距较大的一系列剂量腹腔注射给药,观察出现的症状并记录死亡数,找出引起0%及100%死亡率,至少应找出引起20%~80%死亡率的剂量范围,以保证量-效曲线跨越足够的范围.普鲁卡因小鼠腹腔注射(ip)引起0%和100%动物死亡的剂量范围的参考值为:最小剂量(Dmin)121.3mg/kg,最大剂量(Dmax) 290mg/kg.

  2.剂量计算及药液配制

  (1)剂量计算

  根据预试结果找出Dmax及Dmin,设正式实验的剂量组数为n,剂量公比为r,则各组剂量为Dmax·rk-1,k为第几组,一般选用4~5组动物,r为0.6~0.85为宜.

  例 已知普鲁卡因Dmin=121.3mg/kg, Dmax=290mg/kg

  当n=6时,r=0.84, 各组剂量为:

  1. 290 mg/kg

  2. 290 mg/kg×0.84 = 243.6mg/kg

  3. 290 mg/kg×0.842= 204.6mg/kg

  4. 290 mg/kg×0.843= 171.9mg/kg

  5. 290 mg/kg×0.844= 144.4mg/kg

  6. 290 mg/kg×0.845= 121.3mg/kg

  (2)药液配制

  ①药源充足时的配药方法

  最高浓度药液(母液)的配制

  小鼠腹腔注射体积为0.2ml/10g= 20ml/kg,每组药液量为4ml左右,为留有余地,各组动物所需药液体积定为6ml.

  求出所需母液体积(V)及母液所需药量(M)

  V=各组动物所需药液体积 / (1-r)= 6 / (1-0.84)=37.5ml

  M = V ´ Dmax/(20ml/kg)=37.5´(290/kg) /(20ml/kg)=543.75mg

  各剂量组药液按下法稀释:

  

 

  ②药源紧张时的配药法

  各组所需母液的体积(ml)为:第一组 6,第三组 6´r2,第五组 6´r4,第二组 6´r,第四组 6´r3,第六组 6´r5母液总体积(V)=6´(1+ r+ r2+ r3+ r4+ r5)

  总药量(M)=母液总体积´Dmax/(20ml/kg)

  计算出V、M后,取药量M,用生理盐水稀释至Vml,用移液管精密吸取各组所需的母液量,加生理盐水稀释至6ml,即为各组试验药液.

  3.动物分组:将小鼠雌、雄分开.分别称重,同一重量段(如 18.0—18.9g)小鼠放入一个笼内,标记小鼠.雌、雄小鼠分别按重量顺序分层随机分为6组,使不同性别和体重的小鼠能均匀分配于各组,每组10只.

  4.给药:各组动物分别腹腔注射相应浓度的药液0.2ml/10g,立即详细观察,记录动物反应情况、死亡时间和数目.在24h内作多次观察,以后每天观察1次以上,连续观察7~14天.按Bliss法及其它方法计算LD50和95%可信限(由于Bliss法计算复杂,可用相关的软件进行处理).

  【结果】记录于表T1-1.

  【注意】

  (1) 随机性:实验中能控制的因素尽量使之均衡化,难以控制的因素也应力求严格随机化.分组时应先将不同性别分开,再将不同体重分开,然后随机分配,此法称为分层随机分组法.

  (2)剂量按几何级数排列,转换为对数后,剂间为等距,便于计算结果,估计误差.相邻高低剂量之比一般为1:0.6~1:0.85,剂距小,结果较精确,但过小易出现反应率颠倒的情况.剂距的大小也与给药途径有关,静脉给药时,剂距可偏小,灌胃给药时可适当偏大.

  (3)药物及给药途径应以静脉注射、腹腔注射和灌胃给药为主,选取的途径必须包括推荐临床给药途径.

  (4)LD50受试验中多种因素的影响,如动物的品系、性别、年龄、饥饱以及环境因素中室温、湿度、光照、时辰(上、下午)等.当进行两药的毒性比较时,应尽可能在相同条件下进行,以减少抽样误差.

  (5)在试验过程中应详细记动物的中毒症状及可能致死原因,必要时解剖死亡动物肉眼观察,如发现有组织病变时,可进行组织学检查,通常动物死亡多出现在给药后1~2日内,但全部试验应观察7日以上,如遇有迟发性或进行性中毒反应时,需根据实际情况延长观察时间.若发现中毒反应和死亡率对不同动物性别有明显差别,则应选择比较敏感的性别进行试验.

  (6)当药物毒性小,以最大浓度和最大体积给药后仍测不出致死毒性时,可测定最大耐受量:即用临床试验的给药途径,以动物能耐受的最高浓度、最大容积的剂量1次或1日内连续2~3次给予动物(小白鼠至少20只,雌雄各半),连续观察7天,详细记录动物反应情况,以不产生死亡的最大剂量为最大耐受量.