您现在在位置: » 内容
实验技能SOP:生物样品的采集及实验动物的解剖和脏器系数测定标准操作规程(SOP)
作者: 来源: 2014-08-08

  关键词:生物样品的采集 实验动物 解剖 脏器系数测定

  目的:在药物毒理学研究中,常常需要收集实验动物的血液、尿液或其它体液进行常规检查或生化分析,因此,正确采集实验动物的生物材料是药物毒理学最基本和最重要的操作技术。对实验动物进行大体解剖检查是药物毒理实验的常规观察项目,简便易行并能提供重要资料。测定动物死后器官湿重和含水量是常用的指标之一,可以从大体标本大概地估计内脏器官病变的程度,特别适用于某些可致内脏水肿、实质细胞肿胀、间质纤维组织增生或脏器萎缩等药物的研究。组织匀浆的制备以及在匀浆技术的基础上发展起来的亚细胞结构分离技术,也是药物毒理实验的重要技术之一。学习和掌握药物毒理学试验中常用的生物材料的采集方法;实验动物的处死方法、大体解剖检查、脏器系数和含水量的测定以及组织匀浆的制备;了解病理切片常规收集样本的部位和方法。

  主体内容

  (一)血液的采集

  1、大鼠与小鼠的采血方法:

  ① 鼠尾采血:当所需血量很少时采用本法。固定动物并露出鼠尾,将尾部浸入45~50℃温水中数分钟,使尾静脉充血,擦干,再用酒精棉球擦试消毒。剪掉尾尖(约0.2~0.3cm),拭去第一滴血。然后用血色素吸管定量吸取尾血,或将尾血直接滴入容器内。采血完毕用干棉球压迫止血。亦可不剪尾,用7~8号注射针头连上注射器直接刺破尾静脉采血。

  ② 眼眶静脉丛采血:当需用中等量的血液,而又避免动物死亡时采用本法。左手拇指及食指紧紧握住大鼠或小鼠颈部,压迫颈部两侧使眶后静脉丛充血,但用力要恰当,防止动物窒息死亡。右手持玻璃毛细管从右眼或左眼内眦部以45°角刺入,刺入深度小鼠约2~3mm, 大鼠4~5mm。若遇阻力稍后退调整角度后再刺入,如穿刺适当,血液能自然流入毛细管内。得到所需的血量后,即除去加于颈部的压力,拔出毛细管,用干棉球压迫止血。

  ③断头采血:当需用较大量的血液,而又不需继续保存动物生命时采用本法。左手握住动物,右手持剪刀,快速剪掉头颈部,倒立动物让血液滴入容器。需注意防止断毛落入容器中。

  2、家兔采血方法:

  ① 耳缘静脉采血:本法为最常用的取血方法之一,可多次反复取血。将家兔固定于兔箱中,拔掉拟采血耳缘部细毛,用手指轻轻弹耳或电灯照射兔耳,使耳部血管扩张,然后消毒。左手压迫耳根,用针头刺破静脉或以刀片在血管上切一小口,让血液自然流出。也可直接用注射器进针耳缘静脉抽取血液。采血完毕用干棉球压迫止血,如一时不易止血,可用木夹夹住耳壳10~20分钟。

  ② 心脏穿刺采血:将家兔仰卧位固定在兔台上或由助手捉持,在左胸第2~4肋部剪毛,常规消毒。于第3~4肋胸骨左缘心跳最明显处穿刺,针头刺入心脏后即见血液涌入注射器。采血完毕迅速将针头拔出,这样心肌上的穿刺孔较易闭合,针眼处用酒精棉球压迫止血。体重2公斤的家兔每隔2~3周可重复采血 10~20ml。

  ③股动脉采血:将家兔仰卧固定在兔台上,左手拉直动物后肢,右手持注射器,以血管博动为指标,将针头刺入股动脉。若已刺入动脉,即有鲜红色血液流入注射器。抽血完毕迅速拔出针头,用干棉球压迫止血。

  3、狗的采血方法:

  ① 后肢外侧小隐静脉和前肢皮下头静脉采血:本法最常用,且方便。后肢外侧小隐静脉位于后肢胫部下1/3的外侧浅表的皮下,由前侧走向后上侧,前肢皮下头静脉位于前肢脚爪上方背侧的正前方。抽血前,将狗固定在狗台上或使狗侧卧,由助手固定好。剪去抽血部位的毛,常规消毒。一人用力压迫静脉近心端或用止血带绑紧,使静脉充盈,另一人持注射器进行静脉穿刺。取得所需血量后拔出针头,以干棉球压迫止血。

  ②耳缘静脉采血:当需少量血液或作血常规检查时,可用狗的耳缘静脉采血法。剪毛后先将狗的耳壳加热,或用二甲苯棉球擦耳壳,然后以刀片切割已扩张的血管,使血液滴入容器。采血完毕,以干棉球压迫切割口以止血。

  4、采集血液的注意点:

  ① 实验动物一次采血量过多或采血过于频繁,都可影响动物健康,造成贫血甚至

  死亡,其最大安全采血量见表1。

  

 

  ② 采血方法的选择,主要取决于实验的目的和所需血量的多少,所需血量较少时可刺

  破组织取毛细血管的血,当需血量较多时可作静脉采血,若需反复多次静脉采血时,应自远心端开始。

  ③ 若需抗凝全血,在注射器或试管内需预先加入抗凝剂,常用的抗凝剂有:

  A、草酸钾:常用于供检验用血液样品的抗凝。在试管内加饱和草酸钾溶液2滴,均匀浸湿管壁后,放入烘箱(80℃)烤干,包好备用。每管能使3~5ml血液不凝固,供钾、钙含量测定的血样不能用草酸钾抗凝。

  B、肝素:取1%肝素溶液0.1ml于试管内,均匀浸湿试管内壁,放入烘箱(80~100℃)中烤干。每管能使5~10ml血液不凝固。市售的肝素注射液每ml含肝素12.500 U,相当于肝素钠125mg。

  C、枸橼酸钠:3.8%的枸橼酸钠溶液1份可使9份血液不凝固,用于红细胞沉降速率测定。因其抗凝作用较弱而碱性较强,不适用于供化验用的血液样品。

  (二)尿液的收集

  1、一次尿收集法:在实验研究中,有时为了某种实验目的,要求每间隔一定的时间收集一次尿液,如每4小时收集一次,以观察药物的排泄情况。此种情况下,常用以下方法收集尿液。

  ①逼尿法:本法适用于兔、猫。助手把动物抱住,操作者右手由腹腔向下逐渐用力压迫膀胱,逼出尿液。

  ②导尿法:本法适用于兔、猫、猴和狗等动物,是较常用的方法之一。动物取仰卧位固定于手术台上,尿道口常规消毒。以左手充分暴露尿道口且固定之,右手持导尿管(尖端涂有消毒凡士林或液体石蜡)顺尿道轻而慢地插入,家兔插入约8~12cm,一旦进入膀胱腔,即见尿液流出。若无尿流出,可将导尿管适当上下左右移动,到尿液流出为止,然后用胶布将导尿管与动物体固定。

  ③输尿管插管法:本法适用于兔、猫、猴和狗。以兔为例:将兔麻醉后仰卧位固定在手术台上,于耻骨联合上缘沿正中腹白线作一4~6cm的切口,打开腹腔,在膀胱底两侧找出左右两根输尿管,分离后于两根输尿管下各穿两根线,一根结扎近膀胱端,在结扎线上方向肾脏方向剪一小口插入导管,用另一线结扎。将两根导管的游离端一并放入量筒内收集尿液。实验过程中,应用温生理盐水纱布覆盖手术野,以保持腹腔温度。

  2、连续收集尿液的方法

  大鼠和小鼠的留尿法:在小动物的毒理实验中,常常收集24小时或某特定时间内的尿液。为此常用代谢笼配上粪尿分离漏斗收集尿液,此装置除支架外均用玻璃或有机玻璃制成,便于清洗。该装置主要包括圆形有机玻璃笼罩,带孔的圆玻璃底盘,供饮水和食料的装置,锥形集尿漏斗和粪尿分离器等。动物置于代谢笼内,粪尿分离漏斗的侧口接一只150~200ml的集尿容器收集尿液。

  一般5~6小时内,平均每只小鼠可收集到0.4~0.5ml的尿液。如留尿前给予灌胃,每克体重灌液0.02ml,则可增至0.7~0.8ml。未经水负荷的正常大鼠,排尿量约为0.5ml/100g体重/小时。

  猫和兔连续集尿装置的组成部分与大鼠的基本相同。但代谢笼常用铁丝和搪瓷制成。集尿的容器要大一些。

  3、收集尿液的注意点

  ① 尿液收集器必须保证粪尿分开,防止粪便污染尿液。标本容器务须洁净,其容量视动物而定。

  ② 标本收集后,须在新鲜时进行检验,若需放置时间较久,则须贮放在冰箱或加入适当的防腐剂。

  ③ 分析尿中金属离子时,代谢笼等应避免用金属材料制成,集尿容器最好用聚乙烯材料的。

  ④为了满足实验所需尿量,在收集尿液前,可灌喂适量的水及青菜。

  (三)其它体液的采集

  1、精液的采集:研究药物对雄性动物生殖系统的作用时,精液的观察甚为重要。常用的采集精液的方法有人工阴道法、按摩法、电刺激法及麻醉法等。实验小动物如大、小鼠,也可以采集雌鼠阴道内的阴栓来检查精液凝固后的情况。鼠于交配后,精液在阴道内凝固,如一白色栓塞堵在阴道中,叫做阴栓。小鼠的阴栓比较牢固,可在阴道内存留1~2天;大鼠的阴栓不牢固,容易脱落。所以,检查大鼠的阴栓时,除检查阴道外,还应在笼底寻找阴栓。出现阴栓说明已经交配。

  狗的精液采集可用简便的办法:将雄狗带到发情雌狗的狗舍(雌狗一年内二次发情期,经常在1~2月和6~8月,每次可持续20~25天),因雌狗在发情期,外生殖器官红肿并分泌很多特殊血性分泌物,当雄狗接近发情雌狗嗅到这种分泌物时,可引起雄狗发情。此时立即将雄狗拉上狗台,在雄狗已勃起的阴茎根部轻轻压迫,即可引起雄狗射精。三种常用实验动物精液正常值如表2。

  

 

  2、唾液的采集:一般可引用食饵诱使唾液分泌,再从口腔内采集。另外,还可用唾液腺导管引出法,分离出腮腺(或颌下腺与舌下腺)唾液导管,插入细塑料管,采集唾液。

  3、胃液的采集:将胃管经动物口腔插入胃内,在胃管的出口端连接注射器吸取胃液。一般在禁食6小时后抽取。

  (四)实验动物的处死方法

  1、大鼠和小鼠的处死方法:

  ① 脊椎脱臼法:右手抓住鼠尾用力向后拉,同时左手拇指与食指用力向下按住鼠头。将脊髓与脑髓拉断,鼠便立刻死亡,这是小鼠最常用的处死方法。

  ② 断头法:用剪刀在鼠颈部将鼠头剪掉,迅速将鼠身倒置放血,由于剪断脑脊髓和大量失血,会很快死亡。但易引起肺淤血,因此,重点观察肺部病变的实验,不宜采用此法。

  ③ 击打法;右手抓住鼠尾,提起,用力摔击其头部,鼠痉挛后立即死亡。或用小木锤用力击打鼠头部也可致死。

  ④ 急性失血法:可采用鼠眼眶动脉和静脉急性大量失血方法使鼠立即死亡。左手拇指和食指尽量将鼠头部皮肤捏紧,使鼠眼球突出。右手持弯头小镊,在鼠右侧眼球根部将眼球摘去,并将鼠倒置,头向下,此时血液很快从眼眶内流出。

  ⑤ 化学致死法:吸入CO,大、小鼠在CO浓度为0.2~0.5%环境中即可致死。

  另外,皮下注射士的宁(小鼠0.76~2.0mg/kg,大鼠3.0~3.5mg/kg),吸入乙醚、氯仿均可致死。

  2、家兔和狗的处死方法:

  ① 空气栓塞法:向动物静脉内注入一定量的空气,使动物发生空气栓塞,形成严重的血液循环障碍而死亡。一般家兔注入20~40ml空气,狗注入80~150ml空气即可致死。本法优点是处死方法简单、迅速,缺点是由于动物死于急性循环,各脏器淤血十分明显。

  ② 急性失血法;先使动物麻醉,暴露股三角区或腹腔,再切断股动脉或腹主动脉,立即喷出血液。用一块湿纱布不断擦去切口周围处的血液和血凝块,同时不断地用自来水冲洗流血,使切口处保持通畅,动物在3~5分钟内即可死亡。采用本法动物十分安静,对脏器无损害,但器官贫血比较明显,是目前活杀采集病理标本较好的方法。

  另外,对家兔也可用木锤用力锤击其后脑部,损坏延脑,造成死亡。也可注入一定量的化学药物,如氰化钾溶液、福尔马林溶液、士的宁等造成死亡。

  (五)实验动物的剖检方法

  动物尸体取仰卧位,将四肢固定,用水浸湿被毛。从下颌中央开始到耻骨联合正中垂直切口,用骨剪把左右肋骨剪断后,将胸骨向前下方翻开,即可暴露胸、腹腔。按胸腔、腹腔、颅腔的次序观察各脏器位置、形状及彼此相互关系,然后分别取下。先在胸腔入口处切断食道和气管,将心和肺一起取出。再依次摘除腹部脏器脾、肝、肾上腺、肾、胃、肠和盆腔器官,分别进行各脏器的检查。

  在解剖和取材时,应尽量减少由于器械或手术粗暴引起的机械损伤。刀、剪要锋利,镊子应尽量镊在不重要的部位,以减少人为损伤。

  1、呼吸器官:先检查喉头、声门粘膜有无出血和水肿,两侧肺表面有无出血、感染、肺实变或肺气肿现象。再剪开气管、支气管及其分支,检查粘膜有无充血、出血、感染情况,有无泡沫样炎性渗出液、肺的切面有无实质性病灶、气肿、萎缩、出血等病变。

  2、心脏:剪开心包膜,暴露出心脏,注意心脏的大小、外形和心外膜情况。自下腔静脉入口处将右心房作直线剖开,然后从此线的中点沿心脏右缘剖至心尖部,再从心尖部在心室膈右侧沿冠状动脉沟平行地剖至肺动脉,观察右心的心肌、心内膜、三尖瓣和肺动脉瓣有无病变。自左右肺静脉入口处将左心房直线剪开,沿心脏左缘剖至心尖部,再从心尖部在心室膈左侧向上剖开左心室的前壁到主动脉,观察左心的心肌、心内膜、二尖瓣和主动脉瓣有无病变。

  3、肝脏:观察肝脏的形状和色泽,包膜有无增厚粘连,肝实质有无充血、出血、淤血和脂肪变,切面肝小叶的结构是否清晰,门静脉、胆管和血管有无扩张等。切开胆囊(大鼠无胆囊),检查胆囊充盈程度、胆汁性状(颜色、透明度、浓度)和粘膜的形态。

  4、脾脏:观察脾脏的形态、质地(坚硬、柔软、脆弱)、体积大小和色泽、包膜表面是否平滑或有皱纹,切面滤泡、小梁和红髓的结构,正常动物这三种结构清晰可见。

  5、肾脏:注意肾脏外形、大小、软硬度,包膜有无粘连、肾表面有无凹凸不平等。自肾凸面对准肾门作一纵切面,切面应使肾盂对半剖开,检查皮质和髓质的界限、颜色、斑点等。肾盏和肾盂有无充血、出血、异常内容物的积聚。根据实验需要,亦可以一并剪开输尿管、膀胱进行检查。

  6、胃肠道:从食道下端沿胃大弯从贲门经胃底剪到幽门,注意胃内容物、胃粘膜颜色,有无增厚、出血、溃疡和瘢痕。检查各段肠道浆膜,肠系膜及其淋巴结的情况,拉开肠系膜观察有无寄生虫感染。

  7、生殖器官:剪开睾丸鞘膜检查鞘膜及腔内液体后,将睾丸、附睾一起切开,观察睾丸、附睾有无病变。雌性动物应检查卵巢、输卵管及子宫等有无病变。

  8、脑和脊髓:打开颅腔(小动物只需要普通家用剪刀及小骨钳,大动物则需要弓形锯),先观察硬脑(脊)膜有无充血、出血、渗出等异常变化。然后从正中剪开硬脑(脊)膜,检查脑实质各部分有无异常变化。

  (六)脏器系数和脏器含水量的测定

  脏器系数指内脏器官重量与体重(kg或100g)的比值,含水量(g)指器官湿重与干重之差。其方法是动物在麻醉下用急性失血法处死,按上述剖检的顺序依次摘取所需脏器,用生理盐水稍加漂洗后吸干脏器表面水份,立即在感量为百分之一克天平上称重,称得的重量除以体重即得各脏器系数。测定含水量的部分,放在恒重的器皿中,准确称其湿重后,将组织尽量剪碎,在105℃烘箱中烘烤2小时后,称其重量,再用同法烘烤,直至恒重,然后计算干、湿重差即得各脏器含水量。

  (七)动物解剖后组织标本的选取

  药物毒性实验中,动物剖检除大体观察外,要求各脏器必须制作病理切片,在显微镜下观察其细微变化。因此,对动物尸体解剖的同时,应选取组织块,供制片检查。常规采取组织的部位及块数如下:

  心脏:1~2块,即左室前壁连同乳头肌1块,右室心肌1块。

  肺脏:2块,即左、右肺各一块。左肺切成三角形,右肺切成四方形。

  肝脏:1块,肝右叶(带包膜)。

  脾脏:1块(带包膜)。

  肾脏:1~2块,即左、右肾各1块。左肾切成三角形,右肾切成四方形。

  肾上腺:1~2块,即左、右各1块,一侧厚些,一侧薄些以便区分。

  胃:1块

  肠:4块,即十二指肠、小肠上段和中下段、结肠各1块。

  睾丸或卵巢:1块。

  脑:根据实验要求而定。

  取下的组织块立即固定于固定液中,常规固定液为10%福尔马林。

  (八)实验动物组织匀浆的制备

  动物处死后,立即取出所需组织,置于干冰内备用。或置于冰块上,轻轻除去表面的凝血及结蒂组织等附属物,再经冰冷生理盐水洗涤几次,用滤纸吸干水份,称取一定重量的组织备用。如有特殊需要或短期保存,应放入液氮中或冰箱冻结。

  将已剥离处理好的脏器定量置于匀浆器中,按设计要求加入一定比例的溶液。以肝组织匀浆为例,称取1克重的肝组织,在表面皿内剪碎后,以1:9(1份肝组织加9份0.155M KCl溶液)在匀浆器中稀释,用电动搅拌器以3,000转/分的转速研磨2~3分钟。再经3,000转/分的转速,在4℃中离心10~15分钟。取上清液即可测定肝组织匀浆的酶活力(GPT或GOT)。

  当制备组织药物萃取的组织匀浆时,基本方法同上,但匀浆的操作不一定在冷冻条件下进行。组织块与适宜比例的无离子水研磨成匀浆后,匀浆不必离心。但有时需水解,使结合的药物变成游离状态,再加入萃取用的有机溶剂,振荡、抽提,使药物或代谢产物萃取入有机溶剂内,从而达到与组织分离的目的。