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实验技能SOP:大鼠新生鼠灌注取脑及后固定规则(SOP)
作者: 来源: 2014-08-08

  关键词:大鼠 新生鼠 灌注取脑 后固定

  目的: 完整取出鼠脑及后期固定

  操作步骤

  流程:1)麻醉 2)开胸 3)心脏解剖 4)生理盐水冲水 5)4%多基甲醛固定 6)取脑 7)保存或切片.

  1 多聚甲醛的配置:

  一般方法为:4%多聚甲醛PBS缓冲液配法:称取40g PFA溶于装有800ml PBS的玻璃容器(烧杯或烧瓶)中,持续加热磁力搅拌至60~65℃,使成乳白色悬液.用1.0mol/L的NaOH值至7.0,使呈清亮状(滴加),过滤后定容至1000ml,室温或4℃保存备用.

  2 实验准备:准备两个10ml注射器,剪刀,弯镊、PBS 10ml/只、4%PFA 10ml/只.

  3 麻醉后开胸:因老鼠较小,可冰冻麻醉,或者用致死量麻醉.沿肋弓下向左右剪开,至双侧腋中线向上剪开,然后向上翻起胸壁,充分暴露心脏.

  4 心脏穿刺:在右心耳处用针扎出一个小孔,用装有PBS针筒在左心室进行穿刺.

  5 灌流:缓慢灌注PBS 10ml,见到老鼠两前肢及两肺变白可改灌注多聚甲醛,多聚甲醛的灌流也同PBS.

  6 灌注成功的标志:刚开始灌注时老鼠剧烈抽动;成功后老鼠后肢绷直,尾部竖起成一直线;所灌注的脑组织白而硬.

  7 取脑:分离除去后颈部肌肉 ,用弯镊小心取出脑组织.

  8 后固定:灌流后的脑组织置于4%PFA置4度冰箱内进行后固定,时间>2h,过夜最好.

  优点:可用单人用注射器直接完成,不用输液管架,而且平均每只仅需5~10ml固定液,时间也仅为5~10min.