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2D电泳技术:蛋白质双向电泳过程与体会
作者: 来源: 2014-06-18

  双向电泳IEF (sigma)IEF(not IPG)/SDS-PAGE最简单的装备推荐如下,适合于没多少money做IPG又想做“热”的所谓蛋白质组的.

  IEF用Biorad的圆盘电泳槽(不行用国产的吧,不推荐),SDS-PAGE用六一厂的就可以了(ft,六一厂应该给我money吧,给你做广告了)(money不是很多的强烈推荐六一的,买进口电泳槽的钱留出来测搞出的差异蛋白质的序列吧,呵呵)

  BIO-RAD 的圆盘电泳槽,国产的不推荐,因为 上槽 Biorad 的铂金丝凹进去了一点,不是很进去,而国产的凹得太进去了以至于电聚焦时产生的气泡绕在铂金丝一圈,影响电聚焦.

  双向电泳

  1.蛋白质样品制备

  秧苗蛋白质样品的提取按Davermal 等(1986)的方法进行.100mg 材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂,用液氮研磨成粉,加入1.5 ml 10% 三氯乙酸(丙酮配制,含10mM 即0.07%β- 巯基乙醇),混匀,-20℃沉淀1 小时,4℃,15000 r/min离心15 min,弃上清,沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇),再于-20℃沉淀1小时,同上离心弃上清,(有必要再用80%丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干.

  按每mg干粉加入20μl(可调)UKS液[9.5 M尿素,5mM 碳酸钾,1.25%SDS,0.5%DTT(二硫苏糖醇),2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc,pH3.5-10),6% Triton X-100],37℃育30min,期间搅动几次,28度 (温度低,高浓度的尿素会让溶液结冰)16000 r/min离心15 min,离心力越大时间长一点越好!上清即可上样电泳.或者-70度保存

  2 蛋白质浓度测定

  按Garrels(1983)的程序,稍加改动.10μl上述用UKS液制得的蛋白质样品中加入40μl 水及50μl 20%三氯乙酸,冰浴30min后,4℃,4000 r/min离心15min,弃上清,再加入100μl冷丙酮,同上离心5min,弃上清,冻干沉淀,用100μl PBS溶液复溶,并按Bradford(1976)的程序测定蛋白质浓度.说实话,好象Bradford法不太好做

  2.3.1 电聚焦(IEF)

  2.3.1.1 玻管准备

  干净玻管(18cm×1.5mm)用Parafilm封口膜封好底部,在16cm处作好标记,垂直放在泡沫板上.电聚焦的管子,买原装的也可以,实在不行自己也可以做的,1ml 的移液管,内径1.5mm左右的,长度取18cm,用玻璃刀做,呵呵,很容易的;玻璃管的处理,先用2M 的NaOH 泡 至少 1hr,用自来水冲后;用双蒸水冲,用双蒸水泡至少1hr,中间至少换2,3 次水;后用2M的HCL 泡至少1 个小时,用双蒸水冲,(不能用自来水冲),然后双蒸水泡至少1 个小时,中间换3,4 次水,可多泡一会.最后泡在无水乙醇里面1hr,轰干就可以用了.

  2.3.1.2 凝胶制备与电聚焦

  灌IEF的配方为

  3.09克尿素

  1.125 ml 10%NP-40

  1.125ml 水

  0.735ml 30%屏息现案 (ACR 28.38 BIS 1.62)

  0.15 ml Am 3.5-10

  0.375ml Am 5-7

  8微升 10%AP

  1.8微升TEMED

  用注射器吸好胶液,装上7号针头,将7号针头插入玻管底部,边推注射器边提针头,直到标记处,用微量进样器小心加入少量水,可见明显的界面出现,让其聚合1小时以上,适当长一点的时间好一些,我一般是头天下午灌胶,第2 天下午才开始跑电泳.待胶聚合好后,除去Parafilm并吸去顶部的覆盖液,加样80μg,上面再小心加入50m mol/L NaOH至管口,不要破坏样品与NaOH 的界面.即可进行电泳.电极液为:上槽(负极)为50m mol/L NaOH 液,下槽(正极)为25m mol/L H3PO4.按 200V×15min,300V×30min,400V×18h,1000V×1h的程序进行电聚焦.或者直接400V 17hr 1000V 2hr very important thing is跑第一向一定要在保持在37 度左右,特别是冬天,我的方法是 温控仪控制 暖风机 在37 度暖风机和电泳槽在一个大的纸箱(密封)里.呵呵,应该可以想象得到吧,第一向温度特别重要,不然,电聚焦肯定做不好.2.3.1.3 电泳后的凝条处理

  电聚焦完毕后,用注射器吸满水,套上一个200μl的枪头,当然枪头与注射器间用parafilm封住防漏气.从顶部向下注水使胶条向下滑出.当然,刚开始做的时候肯定不熟,很不爽,有时候你会唱 想哭却又哭不出来,呵呵,熟悉了就快了,注射器 枪头玻璃管必须为一直线,消息不要把注射器的头搞断了.取一胶条,用双蒸水洗净两端,按酸端到碱端的顺序切成0.5cm 的小段,各自浸入含1.3ml 抽气后双蒸水的Eppendorf管中过夜,次日用酸度计分别测定各段的pH值,以凝胶长度为横坐标,pH值为纵坐标作图,即为等电点标准曲线.漫漫挤,管子,200 卫生枪头,注射器,要成一直线,,要用一手扶着管子,一手拿住200 卫生枪头,保证水不从枪头和管子处流出来,注射器顶在胸前把胶条挤出后,放在12%TCA里面,在4度可以保存很久,想什么时候跑SDS-PAGE就什么时候跑.绝招哦,不要随便乱传,嘿嘿!还可以马上看一下,胶条上有蛋白质没有,有的话一下就可以看见了.那些说什么放在平衡液里,-20 度的,肯定不行,呵呵!就跟你用考染IEF 胶条一样的,带,可能先在12%的TCA 里面看不见,不过你再把它放在水里面,泡一会带就出来了.不过在平衡之前,要用dd water泡30min,而且要换至少5 次水,每次用不同的小平皿.

  注意到下级液 磷酸 部分的胶条没,是不是有一节约2cm左右,比较突出,没有膨大的部分呀!只是在tca泡的时候磷酸段有一小截变白的速度比较慢,大约3cm左右,呵呵!

  对要进行第二向SDS-PAGE 的胶条则必须用平衡液[2.3%SDS,62.5m mol/L Tris-HCL(pH6.8),10%甘油,5%β-巯基乙醇,0.1%溴酚蓝]进行二次平衡,第一次20min,第二次25min.第2 次的溶液为新的.一般我是把第2次用过的当成第一次的用 .平衡过程中每隔几min轻轻的晃一下小平皿.

  2.3.2 第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

  选用DYY-Ⅲ型(北京六一仪器厂生产)电泳槽(规格为200×200×1mm),分离胶浓度为12%,无浓缩胶.待胶聚合后,将电聚焦后已经平衡的胶条平放于浓缩胶顶端(避免胶条拉直),并用1%琼脂糖(电极缓冲液配制)封胶,特别应注意避免胶条与分离胶上沿产生气炮.61 厂板子之灌胶:坚决不用凡士林,用透明胶将两端(板子的2 边)封住,再用2%琼脂之SDS-PAGE 电极液封底,待琼脂凝固后再灌胶,最后用水封胶.over!

  做之前,一定要保证,1,灌胶不会有任何问题,不能漏,2,不用浓缩胶,只用分离胶.3,分离胶用水封,要保证凝聚好的PAGE 胶,为一平的线,凹来凸去的就不要用了.玻璃版能用硅化剂最好不过了.防止从边上漏,我用透明胶(约4cm宽),封住两边,下面还是用2%的琼脂封.灌好电极缓冲液[25m mol/LTris,192m mol/L 甘氨酸及0.1%SDS],按25mA/板胶恒流进行电泳,待溴酚兰离底部1cm时即可停止电泳,一般电泳耗时约4-5h.银染:凝胶于40%甲醇,10%醋酸中固定1h以上或者过夜;用水洗1次,5min;30%乙醇洗2×20min;水洗6×5min; 0.02%硫代硫酸钠1min;水洗3×20s;0.2%硝酸银,0.02%甲醛快速的润洗一次,就是过一下的意思,到这个溶液进去,马上又倒掉;0.2%硝酸银,0.02%甲醛20min;水洗3×20s;显色液(3%碳酸钠,0.05%甲醛,0.0005%硫代硫酸钠)快速的润洗一次,就是过一下的意思,到这个溶液进去,马上又倒掉;显色液(3%碳酸钠,0.05%甲醛,0.0005%硫代硫酸钠)显色到你所希望的程度,自己看,背景好,点又多的话就可以了;水洗20秒;0.05%甘氨酸停显.染色理想温度:我去年4,5月时,通常染色都定在中午,12点多;温度最好是20 度左右,(这个温度我也没控制的)100%TCA领一瓶TCA 500g的那种 按分子克隆上的好象是直接加200多ml 水就成100%TCA了10%TCA,0.07%2-ME 丙酮 (100ml):

  100%TCA 10ml

  2-ME 0.07ml

  丙酮 90ml

  0.07%2-ME 丙酮 (100ml):

  2-ME 0.07ml

  丙酮 100ml

  0 Farrel 液(9.5M Urea,2%NP-40,0.4%Am3.5~10,1.6%5~7,5% 2-ME)50ml

  Urea 28.5g

  NP-40 1ml

  Ampholine 5~7 2.0ml

  3.5~10 0.5ml

  2-ME 2.5ml

  注意定容!配好后用1.5ml 管分装!-70度保存

  注意 这两个溶液 配的时候 比如配 50ml 用100ml的烧杯 用量筒量50ml 水 倒如烧杯里面,用记号笔标上刻度,然后把水倒掉,再称 尿素 小量加水,因为尿素加水后体积会变大,再37 度水域锅里溶,然后加其它成分,最后再定到50mlUKS液 (含9.5M Urea,5mMK2CO3,1.25%SDS,0.5%DTT,2%Ampholine(3.5~10),6%Triton X-100)

  25ml 50ml

  Urea 14.25g 28.5g

  K2CO3 17.25mg 34.5mg

  SDS 0.3125g 0.625g

  DTT 0.125g 0.25g

  2-ME

  Ampholine(3.5~10)1.25ml 2.5ml

  Triton X-100 1.5ml 3ml(0.86ml 2 枪,4枪)

  2-ME 可适当加一些!注意定容!配好后用1.5ml管分装!-70度保存!

  双向电泳IPG(summer)

  一、样品提取:三氯醋酸—丙酮沉淀法

  (1)在液氮中研磨叶片

  (2)加入样品体积3倍的提取液在-20℃的条件下过夜,然后离心(4℃8000rpm以上1 小时)弃上清.

  (3)加入等体积的冰浴丙酮(含0.07%的β-巯基乙醇),摇匀后离心(4℃8000rpm以上1小时),然后真空干燥沉淀,备用.

  (4)上样前加入裂解液,室温放置30 分钟,使蛋白充分溶于裂解液中,然后离心(15℃8000rpm以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准),可临时保存在4℃待用.

  (5)用Brandford法定量蛋白,然后可分装放入-80℃备用.

  二、一向电泳(13cm的holder)

  (1)取大约70-100ng的蛋白与溶胀液混合总体积达到250vl

  (2)将上述溶液加到holder 的两个电极之间.

  (3)去掉胶条的保护膜,胶面朝下,先将胶条尖端朝胶条槽的尖端方向放入胶条槽中,慢慢下压胶条,并前后移动,避免生成气泡,最后放下胶条平端,使溶液浸湿整个胶条.

  (4)在胶条上覆盖适量的覆盖油,盖上盖子.

  (5)将胶条槽平放于一向仪器上,与水平方向垂直.

  (6)设置仪器的运行参数:

  三、胶条的平衡(由一向到二向)

  (1)将胶条放入10ml 平衡缓冲液中(加入10mgDTT)封口,在振荡仪上振荡15 分钟.

  (2)将胶条取出放入10ml 新的平衡缓冲液中(加入250mg 的碘乙酰胺)封口,在振荡仪上振荡15 分钟.

  (3)用去离子水润洗胶条一秒钟,将胶条的边缘置于滤纸上几分钟,以去除多余的平衡缓冲液.

  四、二向电泳

  (1)将平衡好的胶条直接转移到第二向制好的SDS胶上,然后用琼脂糖封顶,准备第二向电泳.

  (2)设置仪器的运行参数:五、平板胶的染色

  硝酸银染色:(整个操作在摇床上进行)

  (1)固定:25ml的冰醋酸,100ml甲醇,125ml 去离子水,60 分钟.

  (2)敏化:75ml甲醇,0.5g硫代硫酸钠(使用之前加入),17g醋酸钠,165ml去离子水,30分钟.

  (3)清洗:用250ml 的去离子水清洗3 次每次5 分钟.

  (4)银染:0.625g硝酸银,250去离子水,(使用之前配制)20 分钟.

  (5)显色:6.25g碳酸钠,100vl 的甲醛(使用之前加入),250ml 去离子水.

  (6)终止:5%的醋酸.

  (7)照相分析.

  (8)保存制作干胶.

  药品:

  提取液:含10%TCA 和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮裂解液:2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶于3ml 灭菌的去离子水中(终体积为5ml),使用前再加入1M 的DTT65μl/ml.

  平衡缓冲液:1.5MTris-Cl ph8.8 6.7ml,尿素72.07g ,87%的甘油69ml,SDS 4g,溴酚蓝少许.溶涨液:尿素12g,CHAPS0.5g,溴酚蓝少许溶于无菌水中,总体积为25ml.使用之前再加入IPG缓冲液 0.5vl/100vl,DTT1.5vl/100vl.

  制作平板胶:

  分离胶的配制方法:

  药品/浓度 5% 7.5% 10% 12.5% 15%

  丙烯酰胺 6.7ml 10ml 13.3ml 16.7ml 20ml

  分离胶缓冲液 10ml 10ml 10ml 10ml 10ml

  10×SDS 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml

  无菌水 22.7ml 19.4ml 16.1ml 12.8ml 9.5ml

  10%过硫酸胺* 200vl 200vl 200vl 200vl 200vl

  TEMED* 13.3vl 13.3vl 13.3vl 13.3vl 13.3vl

  *在灌胶之前加入

  药品配制:

  丙烯酰胺单体储液:丙烯酰胺60g甲叉双丙烯酰胺1.6g溶于无菌水中总体积200ml分离胶缓冲液:Trisbase181.5g 溶于750ml 无菌水中调pH8.8总体积1000ml10%SDS:SDS5g溶于无菌水中总体积50ml10%的过硫酸胺:0.1g溶于无菌水中总体积1mlSDS 电泳缓冲液:Trisbase15.1g甘胺酸72.1gSDS5g溶于无菌水中总体积5000ml

  封胶溶液:SDS电泳缓冲液100ml 琼脂糖0.5g溴酚蓝少许附:蛋白质含量测定的方法(Bradford 方法)

  原理:这一方法基于2 考马斯亮蓝G-250 有红蓝两种不同的形式.在一定浓度的乙醇及酸性条件下,可配成淡红色的溶液,当与蛋白质结合后,产生蓝色化合物,反应迅速而稳定.反应化合物在 465-595nm处有最大的光吸收值,化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系,因此可检测595nm的光吸收值的大小计算蛋白的含量.溶液:

  1)Bradford储存液

  100ml95%乙醇

  200ml88%磷酸

  350mgServaG蓝

  室温下长期保持稳定.

  2)Bradford工作液

  425ml双蒸水

  15ml95%乙醇

  30ml88%磷酸

  30ml Bradford储存液

  用滤纸过滤,保存于室温棕色瓶中,可保存数周,但在使用前需要过滤.

  3)配制1mg/ml牛血清蛋白(BSA)

  做标准曲线:取样品即可测量.

  注意事项:

  1、样品的问题:

  样品制备是做好2-d 的关键,这句话好象有点多余,如果样品中离子浓度过大,根本做不了2d,我开始的时候由于提取方法有问题,结果浪费了很多时间和IPG胶条,真的很心痛呀!另外再说明一点,最好用新鲜的样品提取蛋白质,蛋白点的差异很大,新鲜的样品点多,而我用存放在-80 的样品跑出来效果差了很多呀!如果你不确定你的蛋白提的如何,建议你先跑sds-page.检验一下.关于蛋白的提取方法,我还想听听各位的建议.

  2、上样量的问题,我觉得我跑的这张2D 图,上样量还需要调整,可以适当降低,我的ipg 胶条是13 厘米的上样量在50ng-80ng之间,上样量不合适,丰度低的将会被丰度高的所遮盖,这是最讨厌的问题.

  3、跑一向的时候大家都差不多,根据公司的说明就可以做了.跑二向的时候我现在一般做恒压,以前做过恒流,没感觉有什么差异,还想请教各位!横流和恒压到底哪个更好一些!

  4、ipg 胶条ph 的选择,我做的是植物的花药,一般情况下酸性端点多一点,碱性端较少,我现在选用的是ph3-10 的,我觉得很不合适,(不过这个胶条是免费的)因此好多点没能很好的分开,如果胶条的ph小一点,胶条(我希望能达到18cm)可是我们这里做不了,效果应该比这个好很多的!

  5、从这块胶上,我觉得致命点就是背景深,将影响我下一步的分析.所以银染还需要改进!

  6、针对不同的蛋白质,分离胶的浓度也是可以调节的,我比较懒,就作过10%,12.5%的,不过觉得都不适合.