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2D电泳技术:双向电泳完整的操作步骤
作者: 来源: 2014-06-18

  (一)第一向等电聚焦

  1.从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液(I)(不含DTT,不含Bio-Lyte)一小管(1ml/管),置室温溶解.

  2.在小管中加入0.01g DTT,Bio-Lyte 4-6、5-7各2.5ml,充分混匀.

  3.从小管中取出400ml水化上样缓冲液,加入100ml样品,充分混匀.

  4.从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条(17cm pH 4-7),室温中放置10分钟.

  5.沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品.在槽两端各1cm左右不要加样,中间的样品液一定要连贯.注意:不要产生气泡.否则影响到胶条中蛋白质的分布.

  6.当所有的蛋白质样品都已经加入到聚焦盘或水化盘中后,用镊子轻轻的去除预制IPG胶条上的保护层.

  7.分清胶条的正负极,轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘或水化盘中样品溶液上,使得胶条的正极(标有+)对应于聚焦盘的正极.确保胶条与电极紧密接触.不要使样品溶液弄到胶条背面的塑料支撑膜上,因为这些溶液不会被胶条吸收.同样还要注意不使胶条下面的溶液产生气泡.如果已经产生气泡,用镊子轻轻地提起胶条的一端,上下移动胶条,直到气泡被赶到胶条以外.

  8.在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油,防止胶条水化过程中液体的蒸发.需缓慢的加入矿物油,沿着胶条,使矿物油一滴一滴慢慢加在塑料支撑膜上.

  9.对好正、负极,盖上盖子.设置等电聚焦程序.

  10.聚焦结束的胶条.立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳,否则将胶条置于样品水化盘中,-20℃冰箱保存.

  (二)第二向SDS-PAGE电泳

  1.配制10%的丙烯酰胺凝胶两块.配80ml凝胶溶液,每块凝胶40ml,将溶液分别注入玻璃板夹层中,上部留1cm的空间,用MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇封面,保持胶面平整.聚合30分钟.一般凝胶与上方液体分层后,表明凝胶已基本聚合.

  2.待凝胶凝固后,倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇,用MilliQ水冲洗.

  3.从-20℃冰箱中取出的胶条,先于室温放置10分钟,使其溶解.

  4.配制胶条平衡缓冲液I.5.在桌上先放置干的厚滤纸,聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上.将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿,挤去多余水分,然后直接置于胶条上,轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品.这可以减少凝胶染色时出现的纵条纹.

  6.将胶条转移至溶涨盘中,每个槽一根胶条,在有胶条的槽中加入5ml胶条平衡缓冲液I.将样品水化盘放在水平摇床上缓慢摇晃15分钟.

  7.配制胶条平衡缓冲液II.

  8.第一次平衡结束后,彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I.并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上,以免损失蛋白或损坏凝胶表面).再加入胶条平衡缓冲液II,继续在水平摇床上缓慢摇晃15分钟.

  9.用滤纸吸去SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体.将处理好的第二向凝胶放在桌面上,长玻璃板在下,短玻璃板朝上,凝胶的顶慷宰抛约骸?br>

  10.将琼脂糖封胶液进行加热溶解.

  11.将10×电泳缓冲液,用量筒稀释10倍,成1×电泳缓冲液.赶去缓冲液表面的气泡.

  12.第二次平衡结束后,彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II.并用滤纸吸取多余的平衡液(将胶条竖在滤纸上,以免损失蛋白或损坏凝胶表面).

  13.将IPG胶条从样品水化盘中移出,用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸末在1×电泳缓冲液中.然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上.其余胶条同样操作.

  14.将放有胶条的SDS-PAGE凝胶转移到灌胶架上,短玻璃板一面对着自己.在凝胶的上方加入低熔点琼脂糖封胶液.

  15.用镊子、压舌板或是平头的针头,轻轻地将胶条向下推,使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触.注意不要在胶条下方产生任何气泡.在用镊子、压舌板或平头针头推胶条时,要注意是推动凝胶背面的支撑膜,不要碰到胶面.

  16.放置5分钟,使低熔点琼脂糖封胶液彻底凝固.

  17.在低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后.将凝胶转移至电泳槽中.

  18.在电泳槽加入电泳缓冲液后,接通电源,起始时用的低电流(5mA/gel/17cm)或低电压,待样品在完全走出IPG胶条,浓缩成一条线后,再加大电流(或电压)(20-30mA/gel/17cm),待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳.

  19.电泳结束后,轻轻撬开两层玻璃,取出凝胶,并切角以作记号(戴手套,防止污染胶面).

  20.进行染色.