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2D电泳技术:琼脂糖凝胶电泳法分离LDH同工酶及血清LDH总活力的测定
作者: 来源: 2014-06-18

  一、目的:

  1、学习琼脂糖聚胶电泳的原理和方法;

  2、学习酶专一性染色原理及其应用;

  3、掌握分离LDH同工酶的方法;

  4、学习测定血清LDH总活力的原理与方法.

  二、原理:

  能催化同一反应而蛋白质结构不同的酶,称为同工酶.同工酶的蛋白结构既然有差别,它们的理化性质也就有所差异.因此可用电泳或其他方法将它们分离开来.例如乳酸脱氢酶(LDH)同工酶,它们都能催化乳酸脱氢产生丙酮酸,但经电泳法分离后,就有5个同工酶区带.

  由于同工酶在不同组织、器官中的分布不同,即具有组织器官特异性.因此已利用同工酶的酶谱作临床诊断的依据,也被利用于生物分类及遗传育种等工作中.

  本实验是用琼脂糖凝胶电泳法分离人血清乳酸脱氢酶五个同工酶(LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5).血清乳酸脱氢酶的辅酶是NAD .当它催化乳酸脱氢时,NAD 即被还原成NADH·H .

  如果还有氧化型吩嗪二甲酯硫酸盐(N-methyl-phen-azo-nium-metho sulfate,简称PMS)和硝基蓝四唑(氮蓝四唑nitroblue tetrazolium,简称NBT)存在,则发生如下反应:

  当LDH同工酶区带在琼脂糖凝胶板上分开后,给予NAD 、底物(乳酸)、PMS和NBT,同工酶区带即呈蓝紫色.乳酸脱氢酶在辅酶I的递氢作用下,使乳酸脱氢而生成丙酮酸.

  LDH分子量约14万.草酸、乙二胺四乙酸对本酶有抑制作用,所以血浆不适宜测定乳酸脱氢酶活力.此外,硼酸、汞离子、对氯汞苯甲酸以及过量的丙酮酸、乳酸也有抑制作用.

  乳酸脱氢酶催化反应是碳水化合物代谢中无氧糖酵解的最终反应,广泛存在于人体各种组织中,按新鲜重量计算,乳酸脱氢酶活力依下列顺序降低:肾脏>心肌、骨胳肌>胰>脾>肝>肺.血清中含量很低,红细胞中含量较血清约高100倍,故测定时应避免溶血.如不能及时测定,血清应及早和血块分离,避免红细胞中乳酸脱氢酶逸入血清中.

  乳酸脱氢酶测定的方法很多,根据酶作用的反应可分为二大类:一类利用顺向反应以乳酸为基质;另一类利用逆向反应,以丙酮酸为基质.根据测定方法不同又可分为紫外分光光度法和可见分光光度法.紫外分光光度法需用紫外分光光度计测定反应中辅酶I量的变化.可见分光光度法利用2,4—二硝基苯肼和丙酮酸作用,生成丙酮酸二硝基苯腙,在碱性溶液中呈棕色.目前较多使用以乳酸为基质的方法,此法所需的氧化型辅酶I较稳定,不似以丙酮酸为基质的方法需用的还原型辅酶I很不稳定(在-20℃也不能长期保存).氧化型辅酶I价格也较低.此外,乳酸钠基质液也比丙酮酸基质稳定,室温中可放1个月.

  近来有人利用顺向反应形成的还原型辅酶I可以还原某些染料如2,6—二氯酚-吲哚酚(2,6-dichlorophenol-indophenol)、氯化2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基四唑(INT)建立了另外一种类型呈色反应,并以吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)或黄递酶(diapho-rase)作为还原型辅酶I和染料之间的递氢体.此法快速,操作简单,重复性较好.乳酸脱氢酶同工酶显色一般也多利用此类还原四唑蓝方法.

  三、器材及试剂:

  ① 巴比妥-HCl缓冲液(pH8.4,0.1mol·L-1):溶17.0g巴比妥钠于600ml水,加入1mol·L-1 HCl溶液23.5ml,再加蒸馏水至1000ml.

  ② 0.5mol·L-1乳酸钠溶液:称取5.6g乳酸钠,溶于蒸馏水并稀释至100ml.

  ③ 0.001mol·L-1 EDTA·2Na(乙二胺四乙酸钠盐)溶液:称取EDTA·2Na·H2O372mg,溶于蒸馏水并稀释至100ml.

  ④ 0.5%琼脂糖凝胶:溶50mg琼脂糖于5ml巴比妥-HCl缓冲液(pH8.4,0.1mol/L),加蒸馏水5ml,待琼脂糖溶化后,再加0.001mol·L-1 EDTA·2Na溶液0.2ml,冰箱保存备用.

  ⑤ 0.8—0.9%琼脂糖染色胶:溶80—90mg琼脂糖于5ml巴比妥- HCl缓冲液(pH8.4,0.1mol·L-1),加蒸馏水5ml,待琼脂糖溶化后,再加0.001mol/L EDTA·Na2溶液0.2ml,冰箱保存备用.

  ⑥ 显色液:现用现配.溶50mgNBT(硝基蓝四唑)于20ml蒸馏水(25ml棕色容量瓶),溶解后,加入NAD125mg及PMS(吩嗪二甲酯硫酸盐)12.5mg,再加蒸馏水至25ml.该溶液应避光低温保存,一周内有效.如溶液呈绿色,即失效.⑦ 2%醋酸缓冲液:2ml醋酸(99.5%)加蒸馏水98ml.

  ⑧ 电泳用缓冲液(pH8.6,0.075mol·L-1);巴比妥钠15.45g、巴比妥2.76g溶于蒸馏水,稀释至1000ml.

  ⑨ 0.1mol·L-1甘氨酸溶液:称取甘氨酸7.505g,氯化钠5.85g,用蒸馏水溶解并稀释至1000ml.

  ⑩ 乳酸钠缓冲基质液(pH10.0):在乳酸钠溶液(65~70%)10ml中加入0.1mol·L-1甘氨酸溶液125ml、0.1mol·L-1氢氧化钠75ml,混和.

  四、操作步骤:

  (一)琼脂糖凝胶电泳法分离LDH同工酶.

  1、琼脂糖凝胶板的制备和电泳:

  将0.5%琼脂糖凝胶水浴加温熔化.取2ml熔化的凝胶液平浇于一洁净的载玻片上(载玻片放在水平台上,载玻片的大小为7.5×2.5cm).

  在凝胶半凝固时,用一小铁棒在1/3处放下,待胶凝固后,用磁铁吸出小铁棒,用滤纸片仔细吸去小槽内液体,此小槽为点样槽(图18-1)

  用微量注射器向小槽内加入新鲜血清15—20μl.将凝胶板放在电泳槽内,两端各以浸有电泳缓冲液的滤纸或纱布作盐桥,点样端靠近阴极.电泳40—60分钟,电压约100伏.

  2、显色:

  约于电泳终止前10分钟,将0.8—0.9%琼脂糖染色胶在水浴中熔化.取此熔化的凝胶0.67ml与显色液0.53ml及0.5mol·L-1乳酸钠溶液0.2ml混匀,立即浇在电泳完毕的凝胶板上,37℃避光保温1小时,即显示出五条深浅不等的蓝紫色区带.最靠近阳极端的区带是LDH1,依次为LDH2、LDH3和LDH4,LDH5则移向阴极端.

  3、固定与干燥:

  将显色后的凝胶板浸于2%醋酸溶液中,2小时后取出,用一干净滤纸覆盖凝胶板上,50℃烘1.5—2小时,烘干后,取下滤纸,背景即透明.

  如需定量,可用凝胶成像分析系统或光密度计测定各区带.

  (二)LDH活力测定

  1、标准曲线绘制见表18-1.

  单位定义 以标本100ml即100ml原血清在37℃作用15分钟产生丙酮酸分子1个微摩尔为1个单位.

  五、结果与讨论:

  1、用凝胶成像系统对LDH同工酶各组分进行定量.

  2、计算出血清LDH总活力:

  ①绘制出标准曲线

  ②按下述公式计算LDH总活力

  3、总结出来实验中电泳分离LDH操作的关键步骤.

  4、写出酶活力测定中的注意事项.