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2D电泳技术:双向电泳的实验过程
作者: 来源: 2014-06-18
实验原理
2-DE的第一向电泳等电聚焦是基于等电点不同而将蛋白粗步分离,第二向SDS-PAGE是基于蛋白质分子量不同,而将一向分离后的蛋白进一步分离。这样就可以得到蛋白质等电点和分子量的信息。
主要试剂
1. BSA
2. Bradford液
3. DTT 
4. 0.05% 的溴酚兰 
5. IPG buffer (pH 3-10)
主要设备
1. 振荡器
2. 高速离心机
3. 紫外分光光度计
4. 双向电泳设备
实验材料
纯化后的晶体蛋白
实验步骤
1. 样品的溶解
    取纯化后的晶体蛋白3.0mg,加入300ul裂解液(1mg蛋白:100ul裂解液)振荡器上振荡10min左右,共处理一个小时。其中每隔10~15分钟振荡一次,然后13200rpm离心15min除杂质,取上清分装,每管70ul,-80oC保存。
2. Bradford法测蛋白含量
    取0.001g BSA(牛血清白蛋白)用1ml超纯水溶解,测定BSA标准曲线及样品蛋白含量。
    取7个10ml的离心管,首先在5个离心管中按次序加入0ul, 5ul, 10ul, 15ul, 20ul 的BSA溶解液,另2管中分别加入2 ul的待测样品溶液,再在每管中加入相应体积的双蒸水(总体积为80ul),然后,各管中分别加入4ml的Bradford液(原来配好的Bradford液使用前需再取需要的剂量过滤一遍方能使用),摇匀,2min在595nm下,按由低到高的浓度顺序测定各浓度BSA的OD值,再测样品OD值。(测量过程要在一个小时内完成)。例如:
编号        蛋白量(ul)         Buffer(ul)         Bradford(ml)       OD595值
1                0                   80                4                0
2                5                   75                4               0.024
3               10                   70                4               0.061
4               15                   65                4               0.091
5               20                   60                4               0.116
Bt4              2                   78                4               0.079
Bt4              4                   76                4        
转Bt4            2                   78                4               0.075
转Bt4            4                   76                4        
标准曲线方程式:Y= aX b.其中Y为 OD值,X为蛋白含量。 a、b通过作图输入数据可知,相关系数通过输入数据,作图,软件分析可得。
OD值测量过程:
    比色皿用70%的乙醇保存,待用时用双蒸水冲洗,再用无水乙醇冲洗,双蒸水冲洗,再加入待测样品溶液润洗,然后,加入样品,测定OD值。
3. 双向电泳第一向---IEF(双向电泳中一律使用超纯水)
   1) 水化液的制备
称取2.0mg 的DTT,用700ul水化液储液溶解后,加入8ul 0.05% 的溴酚兰,3.5ul(0.5%v/v)IPG buffer (pH 3-10)振荡混匀,13200rpm离心15min 除杂质,取上清。在含300ug 蛋白(经验值)的样品溶解液中加入水化液,至终体积为340ul,振荡器上振荡混合,13200rpm离心15min除杂质,取上清。 
   2) 点样,上胶
分两次吸取样品,每次170ul, 按从正极到负极的顺序加入点样槽两侧,再用镊子拨开Immobiline  DryStrip gels (18cm,pH 3-10)胶条,从正极到负极将胶条压入槽中,胶面接触加入的样品。注意:胶条使用前,要在室温中平衡30分钟;加样时,正极要多加样,以防气泡的产生;压胶时不能产生气泡;酸性端对应正极,碱性端对应负极;样品加好后,加同样多的覆盖油(Bio-Rad),两个上样槽必须与底线齐平。
   3)  IPG聚焦系统跑胶程序的设定(跑胶温度为20oC)
S1 (30v, 12hr, 360vhs, step)
S2 (500v, 1hr, 500vhs, step)
S3 (1000v, 1hr, 1000vhs, step)
S4 (8000v, 0.5hr, 2250vhs, Grad)
S5 (8000v, 5hr, 40000vhs, step)       共计44110vhs, 19.5小时,其中S1用于泡胀水化胶条,S2和S3用于去小离子,S4和S5用于聚焦。
   4) 平衡
用镊子夹出胶条,超纯水冲洗后,在滤纸上吸干(胶面,即接触样品那一面不能接触滤纸,如果为18cm的胶条要将两头剪去),再以超纯水冲洗,滤纸吸干(再次冲洗过程也可省略),然后用镊子夹住胶条以正极端(即酸性端)向下,负极端(即碱性端)向上,放入用来平衡的试管中(镊子所夹的是碱性端,酸性端留有溴酚兰作为标记),用平衡液A,平衡液B先后平衡15min。  注:平衡时要注意保持胶面始终向上,不能接触平衡管壁。
平衡第二次时,在沸水中煮Marker 3min,剪两个同样大小的小纸片,长度与一向胶条的宽度等同,然后吸取煮好的Marker,转入SDS—PAGE胶面上,保持紧密贴合;同样在第二次平衡时,煮5%的琼脂糖10ml。
4. 双向电泳第二向---SDS-PAGE 
   1) 配胶(两根胶条所用剂量)
分离胶:(T=8%  80 ml):溶液于真空机中抽气后再加APS和TEMED
30 % 丙烯酰胺储液    21.28ml
分离胶buffer          20ml      10%APS 220ul     TEMED 44 ul 
双蒸水               38.72ml 
浓缩胶:(T=4.8%   10ml)
30 % 丙烯酰胺储液    1.6ml 
浓缩胶buffer          2.5ml     10%APS 30ul     TEMED 5ul 
双蒸水               5.9ml
   2) 灌胶
    将玻璃板洗净后,室温晾干,然后,将电泳槽平衡好,玻璃板夹好,再在玻璃板底部涂上凡士林以防漏胶,倒入正丁醇压胶,凝胶后(这时会出现三条线),用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再用滤纸除水后,倒入浓缩胶,正丁醇压胶,凝胶后,用注射器吸去正丁醇,超纯水洗两次,再加入超纯水,用保险膜封好。
   3) 转移
    剪两个小的滤纸片,吸取Marker后,放入SDS—PAGE胶面的一端。然后,将平衡好的IPG胶条贴靠在玻璃板上,加少量的5%的琼脂糖溶液在胶面上(琼脂糖凝胶在转移前十几分钟的时候配好,水浴加热溶解,并保持烧杯中水处于沸腾状态,至用之前再拿出来),再将IPG胶条缓缓加入SDS—PAGE胶面,其中不断补加5%的琼脂糖溶液,注意不能产生气泡。
   4) 跑胶
浓缩胶  13mA         分离胶  20mA        共约5.5个小时。
5. 银染(两根胶条所用剂量)(银染特别注意用超纯水)
   1)  固定   30min    无水乙醇 200ml 乙酸50ml,用超纯水定容至500ml。
   2)  敏化   30min    无水乙醇 150ml。
Na2S2O3•5H2O  1.5688g
无水乙酸钠          34g  
先用水溶解Na2S2O3•5H2O和乙酸钠,再加乙醇,最后定容至500ml。
   3)  洗涤   5min  ×  3次
   4)  银染   20min     AgNO3   1.25g   用超纯水定容至500ml
   5)  洗涤   1min  ×  2次
   6)  显影       
无水Na2CO3    12.5g   用超纯水定容至500ml,甲醛(37%)0.1ml, 临时加。
   7)  终止   10min     EDTA—Na2•2H2O  7.3g  用超纯水定容至500ml。
   8)  洗涤   5min  ×  3次。
注意事项
整个双向电泳实验中全部使用超纯水,尽量减少离子的影响。