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SDS-PAGE:SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法
作者: 来源: 2014-06-17

  大多数蛋白质与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物,使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的净电荷消除了不同蛋白质分子的电荷效应,使蛋白质按分子大小分离.

  仪器 恒压或恒流电源,垂直板或圆盘电泳槽和制胶模具.

  试剂准备:

  1、2×SDS上样缓冲液(Loading Buffer):(5ml)

  ①量取下列试剂,置于10ml塑料离心管中:

  ②加去离子水溶解后定容至5ml;

  ③小份(1ml/份)分装后,-20℃保存;

  ④拿出来使用的Loading Buffer可在室温下保存一个月左右.

  注:如用于非还原SDS-PAGE,则配制时不加β-巯基乙醇(2-ME).

  2、5×Tris-Glycine Buffer(SDS-PAGE电泳缓冲液):(1L)

  组分浓度:0.125M Tris,1.25M Glycine,0.5%(W/V)SDS

  ①称量下列试剂,置于1L烧杯中:

  Tris 15.1g

  Glycine 94g

  SDS 5.0g

  ②加入约800ml的去离子水,搅拌溶解.

  ③加去离子水定容至1L后,室温保存.

  3、30%丙烯酰胺(100ml):

  ①称量下列试剂,置于250ml烧杯中:

  丙烯酰胺 29g

  N,N′-亚甲基双丙烯酰胺 1g

  ② 向烧杯中加入适量的去离子水,充分搅拌溶解.

  ③ 加去离子水将溶液定溶至100ml,于棕色瓶中4℃保存.

  4、浓缩胶缓冲液--1.0M Tris-HCL(pH6.8):(100ml)

  ①称量12.11gTris置于100ml烧杯中;

  ②加入约80ml去离子水,充分搅拌溶解;

  ③用浓盐酸调节pH值至6.8;

  ④将溶液定溶至100ml;

  ⑤高温高压灭菌后,室温保存.5、分离胶缓冲液—1.5 M Tris-HCL(pH8.8):(100ml)

  ①称量18.17gTris置于100ml烧杯中;

  ②加入约80ml去离子水,充分搅拌溶解;

  ③用浓盐酸调节pH值至8.8;

  ④将溶液定溶至100ml;

  ⑤高温高压灭菌后,室温保存.

  6、10%(W/V)SDS(100ml):

  ①称量10g高纯度的SDS置于100-200ml烧杯中,加入约80ml去离子水,68℃加热溶解.

  ②将溶液定溶至100ml后,室温保存.

  7、10%(W/V)APS(1ml):

  称取0.1mg APS置于1.5ml离心管中,加去离子水1ml溶解即可.

  注:4℃保存,使用时间最好不超过2周.

  8、考马斯亮蓝染色液(500ml):

  考马斯亮蓝R250 0.5g

  甲醇 225ml

  乙酸 50ml

  水 225ml

  9、脱色液(500ml):

  甲醇 50ml

  乙酸 50ml

  水 400ml

  10、分子量标准:供试品的分子量应包括在使用的分子量标准范围之内.

  样品的制备:

  1、菌体样品的处理:

  ① 取300μl培养物于EP管中;

  ② 7000r/min离心5min;

  ③ 弃去上清,加入300μlPBS,振荡混匀;

  ④ 7000r/min离心5min;

  ⑤ 弃上清,加30μl PBS和30μl Loading Buffer,振荡混匀;

  ⑥ 100℃水浴5min;

  ⑦ 12000r/min离心10min;

  ⑧ 小心移取上清到另一EP管中,室温保存备用.

  2、蛋白样品的处理:

  ① 取浓度约为1mg/ml的蛋白样品30μl,加入30μl Loading Buffer,振荡混匀;

  ② 100℃水浴5min;

  ③ 12000r/min离心1min;

  ④ 室温备用.

  测定方法:

  1、配制适量的15%的分离胶,以10ml为例:

  H2O 2.3ml、30%丙烯酰胺混合液5.0ml、1.5mol/L Tris(pH8.8) 2.5ml、10%SDS 0.1ml、10% APS 0.1ml、TEMED 0.008ml.加入TEMED后迅速摇匀.

  2、将配制好的分离胶加入制胶槽中,注意应沿着边缘缓慢加入,千万别进气泡. 凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5CM或距梳子齿约0.5CM处.

  3、轻轻在分离胶溶液上覆盖一层双蒸水(或正丁醇)封胶,使凝胶表面变的平整,静止30min-1h,使凝胶聚合.凝胶聚合后,在分离胶和水层之间将会出现一个清晰的界面,可以微微倾斜模具,检测凝胶是否聚合.

  4、除去上面的水层,再用滤纸吸尽残留的液体.

  5、配制5%的浓缩胶,以3ml为例:

  H2O 2.1ml、30%丙烯酰胺混合液0.5ml、1. 0mol/L Tris(pH6.8)0.38ml、10%SDS 0.03ml、10%APS 0.03ml、TEMED 0.006ml.加入TEMED后迅速摇匀.

  6、迅速将配好的浓缩液添加到分离胶上面,并将梳子插入凝胶内,至梳子齿的底部与前玻璃板的顶端平齐,小心避免混入气泡.将凝胶垂直放置于室温下,约30min凝胶聚合.

  7、将胶板放入电泳槽中,在上下电泳槽中添加1×电泳缓冲液,使凝胶的上下端均能浸泡在缓冲液中.轻轻拔出梳子,注意不要将加样孔撕破.

  8、在电泳槽的泳道中分别添加蛋白Marker和样品10μl.加样时用微量移液器将样品加入样品孔的底部,避免带入气泡.

  9、接通电源,上槽(加样孔端)接负极,下槽接正极,恒压,起始电压75V,待溴酚蓝前沿进入分离胶,电压增加至105V.

  10、 电泳大约需要1.5-2h,待溴酚蓝刚刚跑出分离胶的底部时,切断电源,从电极上拔掉电极插头,取出玻璃板.

  11、 戴上手套,小心移去两玻璃板之间的隔片,利用专用的铲子轻轻撬开玻璃板,小心从制胶板上将凝胶剥下,弃去浓缩胶.在右上角切去小片作为定位标记.

  12、 用清水洗胶,将分离胶放入染色液中慢慢摇动,,染色30min.

  13、 从染色液中将凝胶取出用水漂洗后,将胶放入脱色液中进行扩散脱色,直到背景蓝色褪淡,见到条带.根据具体情况,大约需要换2-4次脱色液.

  结果计算:

  非还原电泳凝胶经扫描进行纯度分析;还原电泳凝胶中分子量标准,经扫描获得分子量标准曲线,计算供试品的分子量.