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减少pcr产物中引物二聚体的方法
作者: 来源: 2014-03-11

减少引物二聚体的方法
1. 从引物自身着手,重新设计引物,这是最根本解决这一问题的办法;
2. 可能模板有问题;
3. 模板浓度过小,适当加大模板量;
4. Taq酶,引物,Mg2+浓度可能过高,可降低它们的浓度;
5. 取你所要加的上下游引物混合后,在100摄氏度下的沸水中煮5分钟,然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却,这时再加入反应体系当中,引物二聚体就会消失的;
6. 所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO,可以增强特异性;
7. PCR反应体系的配制在冰上进行,最后加TAq酶,PCR结束后,产物勿放置在室温下过长时间,有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。
8. 增加循环数;
9. 降低退火温度后有条带,则应逐渐提高温度,若提高温度的同时产物量减少,则考虑增加镁离子浓度(根据扩增片断长度而定,片段长则相应镁离子浓度应该高一些);
10. 若降低退火温度,发现还是只有引物二聚体,而且镁离子的浓度在 20-25mmol/l没有区别,则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀,导致吸取的试剂浓度不对。
11. 以上次的pcr产物作模板二次pcr,可以提高引物与模板的特异性,减少引物二聚体,如果两次时间间隔短的话,可以把原产物稀释100-1000倍,如果间隔较长可以稀释50-100倍
 

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