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PCR基础篇(实验心得总结)
作者: 来源: 2014-03-11

1. PCR前的准备工作
A. 调整加样枪和训练加样的准确性,保证每次吸取的误差到最小。例如两次100ul必须等于1次200ul。重点是1ul以下加样的。保证10次取样的误差到最小。具体操作,可在1/10000的分析天平或者电子秤上来训练。
B. 预定PCR仪的使用时间,按照扩增的引物,模板,酶等的要求以及PCR仪的说明正确设定PCR程序,并检查验证。注意,不要把分和秒的单位搞错了。
C. 确定PCR各个组分的浓度,活性,以及所需的量,提前计算每个组分的用量,在记录本上详细写出来,备用。例如:在只有模板不同的情况下,9个样品
1X 10X
H2O 6.4 64
10 x Ex buffer 1 10
dNTP(2.5mM each) 1.6 16
primerF(10pmol/ul) 0.2 2
primerR(10pmol/ul) 0.2 2
ExTaq(5U/ul) 0.1 1
9.5ul每管,加入0.5ul的模板DNA。
这里配制一个母液的目的在于每一管一些组分例如引物和酶的量非常小,如果分别加样很难吸准确和均匀。多配制一管的目的在于加样过程中枪头和管壁都有部分吸附左右,会损失一部分体积,这样可以保证所有样品的体积正确还可以作为一个阴性对照。
D.灭菌枪头和PCR用的管子,排除污染的可能。
2. PCR反应液(冰上操作)
A. 把除Taq酶之外的PCR组分拿出-20冰箱,完全解冻混匀(不完全解冻会导致组分不均匀影响取样的实际用量)后置于冰上,按照记录本上的量来加入各个组分。顺序一般按照记录本的顺序,每加一个组分,将已加的放置到冰盒的一边和其他未加的区分开。最好是第一个加入水,最后一个加入的是酶(直接从冰箱里吸取所需的量),并且在加入酶之前(为了使PCR各组分混合均匀从而不会因为部分地方浓度不均而导致酶提前部分失活)和加入酶之后(为了是酶在PCR体系里更均匀)都要混合均匀并短暂离心。分装到各个PCR管,加入模板,混合均匀并短暂离心。
B. 每次分装和加样时要注意是否一定取到了样品,尤其在小体积的时候;是否加入了正确的管子;每个PCR管上都要用记号笔注明简单的标记,有利于减少错加和漏加的几率,也有利于反应结束后的分析。如果是单个的PCR管,每加一个样可以向左或者向上移动一行,以和未加样的区分开。
C. 一些不适于反复解冻而又需要频繁操作的组分,例如dNTP,引物等,可以分装为多个小管,每次取小管解冻使用。稀释的模板DNA可以放在4度。扩增用的灭菌去离子水一定要经常更换或者是小管分装使用。
3. PCR反应
将冰上混合均匀并短暂离心的PCR反应管放置到PCR仪上,再次按紧每一个管子的盖子,开始PCR程序。期间配胶并巡视一到两次,防止例如断电,程序错误等意外情况的发生。