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实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)实验流程
作者: 来源: 2014-03-11

实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)实验流程

一、RNA的提取

不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法,因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高,所以,正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法,在实验过程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。

在总RNA的提取过程中,注意避免mRNA的断裂;取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测,如果存在DNA污染时,要用DNase I进行消化(因为在处理过程中RNA极易降解,建议体系中加入适量RNA酶抑制剂)。

二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA

用DNase I 消化DNA
组份 加量
模板(RNA) 10ug
RNase Inhibitor 4ul
DNase I buffer 10ul
DNase I 10ul
DEPC处理H2O 至100ul
混匀,37℃ 90min

三、RNA琼脂糖凝胶电泳

1.1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制:
1) 称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中,向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml的DEPC水,放微波炉里溶化。
2) 待冷却到60摄氏度左右时,加入1ml甲醛,摇匀(避免产生气泡)。倒入凝胶板上凝固30min。
2.取各个RNA样品4µl,加入6×RNA电泳上样缓冲液2µl混匀,加入变性胶加样孔中。
3.120V电压下电泳25min。凝胶成像系统分析。