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免疫检测分析:免疫胶体金标记抗体及检测抗原
作者: 来源: 2014-04-17

  摘要: 胶体金在光镜和电镜中均为有效的标记物,可以检测单一和多重抗原.

  胶体金在光镜和电镜中均为有效的标记物,可以检测单一和多重抗原.胶体金在电解质中不稳定,但被蛋白质包被的胶体金是稳定的.一般常用免疫球蛋白或蛋白A包被胶体金,可作标记二抗进行免疫检测,本方法应用范围广,染色后的样品可以长期保存.

  试剂和设备

  超速离心机

  显微镜

  温箱

  分光光度计

  0.2 um 微孔滤膜

  载玻片,盖薄片,滤纸

  氯金酸钠

  1% 柠檬酸钠水溶液

  山羊抗鼠Ig抗体

  对T淋巴细胞特异的鼠抗人单克隆抗体

  自人外周血分离的白细胞悬液

  10%氯化钠

  1% 聚乙二醇

  0.01mol/L pH7.2的PBS

  1% 戊二醛乙醇溶液

  50%硝酸银溶液(提前一天配制)

  明胶显影液,2g明胶溶解于99ml蒸馏水中,加1 ml甲酸

  [strong]操作步骤

  [/strong](一) 胶体金溶液制备

  1. 称取0.1g 氯金酸钠,溶解于1L去离子水中;

  2. 加热煮沸,剧烈搅拌下,迅速加入25ml新配的1%柠檬酸钠溶液;

  3. 继续煮沸5分钟,至溶液变成桔红色;

  4. 用蒸馏水将溶液的525 nm波长下的光密度吸收值调到 0.8.

  (二) 胶体金的包被

  1.将山羊抗鼠Ig抗体以 36 900 ´g 离心30分钟;

  2.上清液经0.2 nm 滤膜过滤;

  3.确定蛋白质包被的最佳浓度:将蛋白质作连续10倍稀释各1ml,加入5ml胶体金溶液,1分钟后加入1ml 10%氯化钠溶液,静止5分钟;以胶体金溶液为空白对照测定光吸收度,选择最低吸收值的蛋白质浓度用于正式包被.

  4.取50ml胶体金溶液,用0.2M K2CO3调pH值为7.6,按照确定的最佳比例将蛋白质加入并快速混合,让蛋白质吸附2分钟后,加0.5ml 1%聚乙二醇,防止非特异性凝集;

  5.5000´g 离心1小时,弃上清液,将胶体金悬浮于含 1% 聚乙二醇的 PBS中;重复一次;

  6.弃去上清液,将包被的胶体金溶液用5 ml含1% BSA的PBS稀释, 经微孔滤膜过滤后,4℃保存.

  (三) 抗原检测

  1.取20ul人外周血白细胞与5ml T淋巴细胞特异的单克隆抗体在4℃下孵育30分钟;

  2.1000 r/分离心清洗细胞5分钟,2次;

  3.将洗涤后的细胞与20ml(一般效价1:20)胶体金标记的山羊抗鼠Ig抗体在室温下孵育30-60分钟;

  4.1000 r/分离心清洗细胞5分钟,2次;

  5.将细胞涂片于载玻片,用1% 戊二醛固定细胞10分钟,清洗多余固定液;

  6.将载玻片细胞面向上置于放有湿润滤纸的培养皿中,加4滴50%硝酸银溶液和2滴明胶显色液,覆以盖玻片,放入60-65℃的温箱中,显色3-4分钟,直至玻片标本呈现金褐色为止;

  7.移出盖玻片,用蒸馏水迅速漂洗数秒,晾干;

  8.光学显微镜下观察.

  对照试验

  可以用未加一抗的细胞作为对照试验组.

  试验要点及说明

  1.所使用的器皿均应非常洁净,需经过硅烷化处理;

  2.使用高纯度多次蒸馏去离子水;

  3.胶体金颗粒的形成、大小和速度,均决定胶体溶液的稳定性,水质和玻璃表面对启动还原和稳定胶体十分重要,本过程制备的胶体金颗粒直径约为18-20 nm;

  4.因为胶体金在电解质中不稳定,本实验全部操作过程要严格、迅速,注意液体颜色;

  5.蛋白质包被胶体金时的相对最佳浓度要事先测定,测定最佳浓度时,胶体金溶液的pH值也要调节到pH7.6;

  6.一抗和胶体金标记二抗的稀释浓度应事先经预试验以最佳效价.

  参考文献

  1.杨汉民 主编(1997) 《细胞生物学实验》 第二版 高等教育出版社

  2.杨景山 主编(1990) 《医学细胞化学和细胞生物技术》 北京医科大学和中国协和医科大学联合出版社