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免疫检测分析:荧光素标记抗体技术
作者: 来源: 2014-04-17

  摘要: 在碱性条件下FITC的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合,标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力.

  目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocynate,FITC)或罗达明(Lissamine rhodamine B200, RB200).在碱性条件下FITC的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合,标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力.在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光,通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测.

  (一) 操作步骤

  将纯化的IgG抗体对PH9~9.5碳酸盐缓冲液透析过夜,

  透析后抗体液移入小烧杯中

  ↓

  称取适量IFTC,加入二甲亚砜(DMSO)(FITC~1mg/1ml DMSO)

  使终浓度为1mgFITC/1mlDMSO

  FITC/IgG比例:如IgG浓度为1mg/ml,FITC/IgG比例约为50μgFITC/mgIgG;

  如IgG为5~10mg/ml,则比例为25μgFITC/ml IgG

  在10ml小烧杯中先放入抗体

  ↓

  按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中

  ↓

  将标记物用PBS加至2.5ml,磁力搅拌器室温下避光搅拌2h

  ↓

  用PD10柱(Sephadex G25柱)除去游离荧光素,先用25ml PBS淋洗G25柱

  ↓

  收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰,测定F/P

  比值.第二个荧光素峰为游离荧光素

  计算:

  2.87×A495

  F/P=────────

  A280-0.35×A495

  合适的F/P值为2~4.

  (三) 试剂器材

  1. 纯化的多克隆抗体或单克隆抗体.

  2. FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它荧光色素.

  3. PBS、DMSO

  4. PH9~9.5碳酸盐缓冲液: Na2CO34.3g,NaHCO3 8.6g加蒸馏水至500ml.

  5. PD10柱(Sephadex G25柱)

  6. 磁力搅拌器,紫外分光光度计等

  (四) 注意事项

  1. FITC保存于4℃暗处,使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取,以避免潮解.

  2. FITC-DMSO液要临用时配制.

  3. 碳酸盐缓冲液要新鲜配制.