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免疫检测分析:ELISA检测肺炎支原体抗体IgM
作者: 来源: 2014-04-17

  摘要: 下文介绍了ELISA检测肺炎支原体抗体IgM的操作方法.

  [检测方法]: ELISA

  [方法学原理]:

  将微孔表面包被纯化的肺炎支原体抗原,将被稀释过的患者血清加入微孔中,如存在支原体抗体可与微孔上抗原相结合,然后洗去未结合物质,再加入酶标记抗人IgM与抗原抗体复合物结合,洗去未结合的酶标记抗体,最后加入显色液.在特定时间终止显色反应,通过酶标仪校正和对照相比读出结果.

  [标本准备]:

  取新鲜末梢血或静脉血.如采血后24h内不能进行试验,分离血清后将其保存于一20℃环境中.检测时,使样本恢复至室温.

  [试剂]:

  1、预包被微孔板

  2、阳性对照

  3、弱阳性对照

  4、阴性对照

  5、标本稀释液

  6、浓缩酶联物

  7、底物A、B

  8、终止液

  [仪器]: 酶标仪或全自动酶联免疫检测仪.

  [检测步骤]:

  1、配制洗涤液:1瓶浓缩洗涤液加475ml蒸馏水.配好的洗涤液短期内可置室温环境,长期可存于2—8℃环境中.

  2、配制酶联物:按1:101倍稀释,即取10tzl浓缩酶联物加酶联物稀释液l 000ul(根据检测标本数量确定稀释量),未用完的丢弃.

  3、待试剂盒平衡至室温后,待测标本用按1:51稀释,取4ul血清与200u1标本稀释液混合.

  4、将稀释标本置37℃环境中20min.

  5、各加100ul阳性、弱阳性、阴性对照及已稀释待测标本上清液于相应孔中,空白对照孔加100ul标本稀释液,盖好反应板,37℃环境中孵育30min.

  6、甩尽板中液体,每孔用200—300ul洗涤液洗5次,每次均需拍干.

  7、每孔加酶联物100t~l,盖好反应板,37℃环境中30min.

  8、甩尽板中液体,洗5次,每次拍干.

  9、加底物A、B各1滴或各50P1,混匀,37℃环境中15min.

  10、取出,加终止液1滴,用酶标仪450nm测其OD值.若肉眼观察,不加终止液判断结果.

  [结果判断]:

  1、阴性对照平均OD值须小于0.20.

  2、弱阳性对照平均OD值须在0.20~0.65.

  3、弱阳性对照和阴性对照的平均OD值之比须≥2.符合以上3种条件时,本试验结果可信,否则重复试验.

  4、若待测标本孔显色比弱阳性对照孔深则判为阳性,反之为阴性.但在弱阳性对照值上下10%范围内最好再测1次,如确实高于弱阳性对照则可判为阳性.

  [注意事项]:

  1、本试验结果须结合临床表现、病史作出诊断,方可采取适当临床处理.

  2、试剂盒内虽然含有消除干扰因子的物质,但仍可能会有少量标本难以除尽干扰.因此,如果某标本几项IgM均为阳性,应考虑有RF的干扰.

  [临床意义]:

  IgM抗体是早期抗体,于起病第1周末出现,用于早期诊断;IgG抗体是恢复期抗体,于起病2—3周后出现,动态观察可用于确定诊断.