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免疫检测分析:同时检测多种病原之快速诊断鉴定技术-xMAP
作者: 来源: 2014-04-17

  摘要: 下文介绍可以同时检测多种病原的快速诊断鉴定技术-xMAP.

  [strong]一、前言

  [/strong]    对于人类重要疾病病原或动植物有害生物的首次鉴定确诊,通常需依循柯霍氏法则(Koch's postulates)进行,依此法则需满足四项条件:(一)在病患或罹病之动植物上能找到相同的病原;(二)由罹病体分离出来的病原应能纯化或培养;(三)纯化或培养出来之病原接种到实验动物体或相同之动植物时,仍会引起相同之疾病或病征;(四)发病后仍可自接种之实验动物体或动植物中分离出相同病原.但如每次确定病因都经此法则历程的话,则所需耗费的时间相当长,有部分种类甚至还需经各种不同测试始能断定.随科技的发展日新月异,许多疾病在确定病原后,后续之诊断鉴定技术不再繁琐,所花费之时间亦大幅之缩减,尤其在血清学研究方面有关酵素连结免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,简称ELISA)之技术平台建立后,疾病或病原之诊断有了突破性之发展.藉由各种病原或有害生物之多元抗体、单元抗体、抗原、抗血清的纯化,诊断的历程可在数小时至数天内确认结果.而分子生物技术的发达,专一性核酸探针之建立,也使得诊断鉴定灵敏度更大幅提升;聚合酶连锁反应(polymerase chain reaction,简称PCR)技术平台的蓬勃发展,诊断方法也更加多元化,在诊断准确性、速率及效率上均往前迈进一大步.

  [strong]

  二、诊断鉴定技术的要求与发展

  [/strong]    针对单一种病原或动植物有害生物诊断鉴定技术的要求,是期望能够达到(一)准确、(二)快速、(三)简便等三要项.这三要项中首重的是准确,不准确的鉴定结果,即使再简便、再快速也是枉然.在准确的前提下,其次是能够快速的诊断鉴定出结果,此对于阻挡重要疫病原的入侵、蔓延,将可扮演及时关键之角色.在准确与时效上均能符合要求时,简便的操作方式则是另一项重要考虑,当技术、设备或实验室的门坎过高时,则可执行的单位、研究人员便较少,所能发挥共同防杜疫病原入侵之侦测点相对也较少,加上送样至特定实验室需花费许多时间,送样过程也会增加受污染之机率,因此简便的操作技术与过程,将是诊断鉴定技术能否普及之关键因子.目前PCR、ELISA等技术已初步可达成上述三要项之要求,不过在时效上及简便性方面仍诸多改善空间.而应用单一步骤免疫层析法(one-step immunochromatography)所开发之产品如市面上常见验孕棒等,其在时效性及简便性上已有相当大之突破,惟在灵敏度上仍需加强.而国人自行研发之植物病毒诊断试剂套组则已具单一步骤免疫层析法般快速、简便之优点,且其灵敏准确度与实验试所实行ELISA检测法相当,甚至更灵敏,此诊断试剂套组为符合目前针对单一或少数几种有害生物诊断鉴定所要求准确、快速、简便三要项之技术与产品.

  

 

  图1、国人自行研发之植物病毒诊断试剂套组目前已符合准确、快速、简便三要项.

  而当大部分研究室数十年来的深入研究已累积大量重要疾病病原或有害生物专一性探针、抗体、抗原、抗血清时,大多数人便期待针对同一样本能够同时检测数十种,甚至百种、千种之重要疾病或有害生物,进而大幅缩短不同疾病的诊断时程,这个期待因而驱使并孕育了生物芯片的诞生. DNA芯片的出现,让世人眼睛为之一亮,也因而造就许多生技产业的蓬勃发展,但DNA芯片经过这几年来的发展,却也逐渐遭遇到一些亟待克服的瓶颈,包括微数组点阵仪器价格昂贵(从早期的数千万,到现今便宜者仍需数百万不等);芯片制作完成后价格仍高昂;贩卖时也牵涉到相关专利问题;测试结果仍需倚靠判读机器来进行等问题;另外,理论上每片DNA芯片虽可点阵一万点以上之测试点,但就现实应用上似无如此大之需求量,加上同时点阵上千点以上之探针时,所需耗费之成本相当高,但对检测之样本能发挥实际功能之检测点可能不及百分之五.因此,能够同时检测数十种目标点之技术或方法,就目前市场需求面来说应属足够与恰当.

  [strong]三、xMAP检测技术的原理

  [/strong]    为满足大多数研究人员同时检测多种病原或目标物之需求,并克服DNA芯片所遭遇的瓶颈,国外(Luminex Corporation)在三年多前已成功研发完成一种新的检测技术平台,并持续推广应用中.此种检测技术简称为xMAP,英文全名为flexible Multi-Analyte Profiling,由于检测反应均在液态中完成,也称为液相芯片(liquichip).

  1、xMAP的检测法原理叙述如下:

  (一)  利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微珠,包覆不同比例的红光及红外光发色剂,而产生100种不同比例颜色之微珠,每颗微珠之大小约5.6微米(microns),这些微珠可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酵素分析、受体和配体识别分析等,而标定上特定抗体、核酸探针与各种受体探针,为了区分不同的探针,每一种用于标记探针的微珠都带有一个独特的色彩编号.

  

 

  图2及图3、利用聚苯乙烯所制作完成大小约5.6微米,透过不同比例的红光与红外光发色剂所构成100种不同颜色之微珠.

  

 

  图4、xMAP检测技术可依研究目的标定不同探针进行分析.

  (二)  待测样本则以不同颜色之发色剂标定,并将标定探针之微珠与待测物在96孔微盘中进行反应.

  

 

  图5至图7、标定探针之微珠与待测样品之反应过程

  (三)  反应后,利用机器自动将反应液吸起并通过一微细管所构筑之检测通道,每次仅允许一个微珠通过检测信道,检测信道中设有二道雷射光,一道为红色,一道为绿色.红色雷射激发微珠基质中的颜色,并根据微珠中不同色彩编号及分类;绿色雷射则激发待测样本中之颜色,当待测样本与特定微珠之探针吸附在一起时,二道雷射所激发的光皆可被侦测到.而若样本中不含该标的物,则仅有微珠中的激发光可被侦测到.

  

 

  图8至图10、微珠通过检测信道,红色雷射激发微珠颜色,绿色雷射激发待测样品中所标定之颜色.

  (四)  透过机器与计算机自动统计分析二道雷射所激发之微珠种类与数量,从而判定待测样本中有几种测试目标物在其中,意即告知测试样本中有无欲测试之病原存在,或同时存在有几种至数十种之病原.

  

 

  图11、xMAP检测与判读机械设备.

  2、xMAP检测技术之优点

  xMAP检测技术具有下列几项特性,也是日后推广发展之优势:

  (一)  反应快速、灵敏度高:反应环境均在液相中完成,即标定探针之微珠与待测样本均于溶液中反应,其彼此间碰撞机率与速度相对于以往标定探针处为固相、待测样本为液相的反应模式(如ELISA将抗体吸附于微盘中或DNA芯片将探针标定于玻璃、膜片上)理论上增加四倍以上,实际上则可增加十倍.此可大幅缩短反应时间,并有效提升反应灵敏度.

  (二)  可同时检测多种目标物,所需成本较低:本技术具有同时检测多种病原或目标物如同生物芯片之功能,但所使用之机器设备却远较于DNA芯片所需购置微数组点阵仪低廉,目前此类机器设备价格约新台币三百万元.

  (三)  可多元化分析,应用性较广:使用相同的仪器设备可针对不同之研究目的在微珠上标定上DNA探针、抗体探针或各种受体探针等从而进行不同的分析,不若DNA芯片之微数组点阵仪般仅能使用DNA探针而较受限制.

  3、xMAP检测技术之应用实例

  美国研究学者Dr. Richard 等人,利用xMAP检测技术针对100μl待测样本中含有15种不同的细胞因子,进行精确的定量测试,其方法是将15种不同的细胞因子之抗体分别标记在 15种不同颜色之微珠上,混合后加入到一个反应溶液中,并对同一样本中的15种细胞因子进行测试,同时并用ELISA的方法,针对15种细胞因子个别进行检测,之后针对两组结果进行对比后分析,所得之结果大致相同,但xMAP检测技术可在同时间完成多元之分子检测,且灵敏度及可信度上均较高,操作也更为简单,在短时间即获得所需之数据.此实例应证xMAP技术之简便性与实用性.

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  四、结语

  [/strong]    人类对于重大疾病或动植物有害生物诊断鉴定技术的要求,从希望针对单一种类能够达到准确、快速与简便三要项,逐渐转变期待为同一时间可检测多种仍能达到三要项,此促使DNA芯片的产生,但也因DNA芯片在应用上仍有许多限制,驱动更多研发人员开创出xMAP检测技术.期望藉由此篇检测技术的介绍,让国内农业研究人员在进行检测技术开发时能有多一项选择,也期待国人于生活或工作上感觉不便时,能够积极去寻觅解决之道,因为 “不便”,是“开创”的原动力,从而创造新的世局.