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PCR技术:原位聚合酶链式反应
作者: 来源: 2014-04-14

 (一)、仪器设备
    英国Thermo Hybaid原位PCR仪.

(二)、操作流程
 
1、原位PCR步骤

1) 预处理:
    (1) 切片常规脱蜡;
    (2) 0.2mol/L HCl处理10min;
    (3) 5μg/ml蛋白酶K消化组织37℃10min;
    (4) Nase消化组织37℃ 30min;
    (5) 梯度酒精脱水,室温干燥.
2) 原位扩增:
    (1) 切片滴加特异性序列引物30μLPCR扩增反应液,覆盖硅化盖玻片,石蜡油封边;
    (2) PCR热循环:94℃,1min;55℃,1min;72℃,1.5min,共25~30个循环,72℃延伸10min;
    (3) 氯仿洗去盖玻片,4%多聚甲醛后固定10min,梯度酒精脱水,干燥.
3) 原位杂交
    (1) 加地高辛标记探针的杂交液,98℃变性10min,-20℃退火5min,42℃杂交过夜.
    (2) 杂交后用2×SSC洗涤10min,3次,1×SSC洗涤10min,3次;
    (3) 缓冲液洗涤10min,3次;
    (4) 加碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛抗体复合物,37℃,2h;
    (5) 缓冲液洗涤5min,3次;
    (6) NBT、BCIP暗处显色,镜下控制,终止显色.
    (7) 常规脱水:透明、封固.
2、原位RT-PCR步骤
1) 预处理:
    (1) 蛋白酶K(0.3mg/mL) 54℃消化20min,蒸馏水洗;
    (2) 95℃加热3min,灭活残存的蛋白酶.
2) 原位扩增:
    (1) 在有RNA酶抑制剂存在的条件下,用随机六聚物进行逆转录反应;
    (2) 用热启动法进行PCR扩增.标本加热至75℃时加上反应液,覆以盖玻片,四周用指甲油密封.然后将温度升至95℃,2min.再将热循环仪设定为95℃,45s,55℃,1min和75℃,45s,共26次循环;
    (3) 扩增结束后,在80℃烤15min~30min.
3) 原位杂交:
    (1) 杂交前标本95℃加热3min;
    (2) 加上杂交液,湿盒内50℃过夜;杂交液组成:25%硫酸葡聚糖,2×SSC,50%甲酰胺,0.33mg/ml变性的鲑鱼精子DNA, 每0.5mL杂交液内含生物素标记探针1ng.
    (3) 扩增的β-肌动蛋白和IL-6用DAKO检测试剂盒K600(链霉卵白素,生物素标记的碱性磷酸酶和硝基四氮唑蓝)检测.阳性反应呈紫色.