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PCR技术:PCR 引物设计的原则和要点
作者: 来源: 2014-04-14

     引物设计有3条基本原则:首先引物与模板的序列要紧密互补,其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构,再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配).引物设计应注意如下要点: 
    1、引物的长度一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于TaqDNA聚合酶进行反应. 
    2、引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错配.引物3'端出现3个以上的连续碱基,如GGG或CCC,也会使错误引发机率增加. 
    3、引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响.不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率,末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基,因此应当避免在引物的3’端使用碱基A.另外,引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败.5’端序列对PCR 影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物. 
    4、引物序列的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应.上下游引物的GC含量不能相差太大. 
    5、引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳.Tm 值的计算有多种方法,如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T).Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method). 
    6、∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性.应当选用3'端∆G 值较低(绝对值不超过9),而5’端和中间∆G 值相对较高的引物.引物的3'端的∆G值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应. 
    7、引物二聚体及发夹结构的能值过高(超过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行. 
    8、对引物的修饰一般是在5'端增加酶切位点,应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定.

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