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PCR技术:PCR产物克隆的四种方法
作者: 来源: 2014-04-14

   通常情况下,PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接,但其连接效率效低.引物中设计入限制酶切位点:由于PCR引物的5'末端可以增加一些非互补碱基,因此可以在两引物的5'末端设计单限制酶或双限制酶切位点.TaqDNA聚合酶能在平端双链DNA的3'末端加一个碱基,所加碱基几乎全是腺苷.无连接酶克隆法(ligase-free subcloning,LFS)是利用引物5'末端附加碱基修饰法,修饰碱基不是酶切位点,而是与某一质粒两端分别互补的碱基.两引物的3'端约 20-25个核苷酸分别与待扩增DNA两翼互补,5'端各有约24个核苷酸分别与线性化质粒的3'端相同的附加序列.
1.平端连接
通常情况下,PCR产物可直接与平端载体DNA进行连接,但其连接效率效低.因为TaqDNA聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性,能在两6条 DNA链的3'末端加上一个多余的碱基,使合成的PCR产物成为3'突出一个碱基的DNA分子.这种DNA分子的连接效率很低.由于PCR产物的效率通过较高,.在采用大量T4DNA连接酶并配以5-10u T4 RNA连接酶时,可显著提高其连接效率.对于较短PCR产物,用PUS19的HincⅡ位点进行克隆,以X-gal和IPTG筛选,常可得到足量重组子.另一种提高克隆效率的途径是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3'末端突出碱基将PCR产物变成平端DNA,然后再用平端连接法克隆PCR产物.
2.粘端连接
引物中设计入限制酶切位点:由于PCR引物的5'末端可以增加一些非互补碱基,因此可以在两引物的5'末端设计单限制酶或双限制酶切位点.这样得到的 PCR产物用限制酶消化产生粘性末端,即可与有互补粘端的载体DNA重组.这种克隆方法效率较高,且当两引物中设计不同酶切位点时,可有效地定向克隆 PCR产物.其缺点是需要加长PCR引物,除限制酶识别序列外,还需要在其5'端多合成3-4个碱基以利于限制性内切酶与PCR产物末端的稳定结合.即使如此,其酶切效率也不够高.其中尤以NotI、XhoI和XbaI等较为难切.采用突变PCR方法可克服上述缺点.该方法是通过在两PCR引物序列中改变 1至数个核苷酸创造出一个限制性内切酶位点.鉴于PCR引物的3'末端序列的互补性是PCR成功的关键,在PCR引物的中部或近5'端改变1个或几个碱基对PCR扩增效果影响不大.这种方法不需要增加PCR引物的长度,而且酶切效果优于5'加端法.对于特定DNA片段的克隆,此方法较为经济、实用.但对于基因诊断PCR产物的克隆,似乎5'加端法更为适宜.
T4DNA聚合回切产生粘端:如PCR两引物的5'末端是A或T,则可在其5'端分别加上CG和CCGG.用此二引物扩增的PCR产物在dATP和 dTTP存在的情况下,用T4DNA聚合酶进行处理,则T4DNA聚合酶因具有3'→5'外切酶活性而消去3'末端的G和C,产生AccI和XmaI粘性末端(图1).此DNA片段直接与用AccI和XmaI切开的载体进行连接.这种方法只需在PCR引物的5'端加2-4个碱基,但其可选择的限制酶类有限.
3.T-vector法
TaqDNA聚合酶能在平端双链DNA的3'末端加一个碱基,所加碱基几乎全是腺苷.据此,Marchuk等人采用3'端突出一个胸苷的质粒DNA来克隆PCR产物,其克隆效率比平端的连接至少高出100倍.他们用EcoRV将pBluescript切成平端,然后在2mmol/LdTTP存在下,用TaqDNA聚合酶催化pBluescript的两个3'末端各加一处胸苷.因为在4种dNTP都存在时,Taq聚合酶选择性参入dATP,而当仅一种 dNTP存在时,它只能参入该种碱基.因此,在只加入ddTTP时,用TaqDNA聚合酶可使平端载体DNA转变成3'末端突出一个胸苷的T尾载体,称为 T-vector.用这种T-vectorsk可以较有效地直接克隆PCR产物.Hotton等人也报道了另一种制备T-vector的方法.他们使用脱氧核苷酸末端转移酶在切成平端的载体DNA的3'末端加上一个胸苷.由于末端转移酶可以催化多个碱基(ddTTP)作为底物,使平端载体DNA分子的两个 3'末端各加上一个T.用这种方法制备的T-vector的不同之处在于前者3'末端不能与待克隆PCR产物的5'末端连接,仅5'末端可与PCR产物的 3'末端形成磷酸二脂键.
4.共环消解法
最近,Jung等人报道了一种有效的PCR产物克隆方法.用磷酸化的PCR引物扩增得到的PCR产物,先用T4DNA连接酶催化连接反应,使5'端带有限制酶切位点的扩增DNA片段连接成共环结构.然后再用相应的限制酶进行消化,产生粘端DNA片段.对于对称性限制酶位点,只需在引蛾的5'末端加上一关识别序列,因为在串接成共环后能恢复限制酶切位点难于切开的缺点,且可用于双限制酶切位点的设计,只不过有PCR产物共环化后,仅约1/4的限制酶切点得以恢复.故此法较适用于单限制酶位点的克隆.