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PCR技术:全血标本DNA PCR反应模板的制备
作者: 来源: 2014-04-14

 试剂与配制
蛋白酶K:20mg/L 溶于10mmol/L Tris-HCl pH7.5
TE缓冲液(pH7.5 或8.0)
PBS(磷酸盐缓冲液)
钾缓冲液:50mmol/L KCl,10~20mmol/L Tris-Cl,2.5mmol/L MgCl(pH8.3),1%laureth12,0.5% Tween-20,蛋白酶K(100μg/ml)
裂解缓冲液:0.32mol/L蔗糖,10mmol/L Tris-Cl,5mmol/LMgCl2,1% Triton-100
操作方法
方法一
1. 无菌取血200μl置于含有50ul 15% EDTA 的EP管中混匀;
2. 12000rpm离心5min,弃上清;
3. 将细胞团悬浮于50μl溶液(10mmol/L Tris-HCl pH7.6,5mmol/L MgCl2,10mmol/L NaCl)  中,12000rpm离心5s,去上清;
4. 重复 (3) 2~3次;
5. 将沉淀的细胞悬浮于100μl双蒸水中,煮沸5min;
6. 12000r/min离心5min,去细胞碎片;
7. 取上清2~5μl进行PCR扩增。
方法二
1. 取全血50μl于微量离心管中,加入0.5μlTE混匀;
2. 12,000g 离心10s,弃上清,加入0.5μlTE悬浮沉淀,再离心,重复此步骤2次以上;
3. 用100μl钾缓冲液悬浮沉淀,56℃水浴45min,消化细胞;
4. 95℃ 保温10min,灭活蛋白酶K,取10μl上清进行100μl PCR反应。
方法三
1. 在微量离心管中,将0.75ml全血和0.75ml裂解液混匀;
2. 10,000g离心30s,去上清,加入1.5ml裂解液悬浮沉淀。重复此步骤2次;
3. 用117μl含1%SDS的10mmol/L的Tris-Cl(pH8.0)缓冲液溶解沉淀,70℃水浴5min;
4. 冷至55℃,加入4μl蛋白酶K液,55℃1hr;
5. 95℃ 保温10min,灭活蛋白酶K;
6. 加入2mol/L KCl 30μl,冰浴5min;
7. 10,000g离心5min,上清分装后于-70℃储存备用。
方法四
1. 取20μl冷冻保存血或EDTA抗凝血,点加于2.5cm2玻璃纤维滤膜上,晾干;
2. 用铅笔沿血迹划一圆圈,将滤膜置于多孔支持物上,用蒸馏水裂解;
3. 用盐水或水浸洗,除去抑制PCR的蛋白质成分;
4. 晾干后,切取1/8的斑点置于PCR反应液中进行PCR。