您现在在位置: » 内容
DNA提取与纯化:MinElute DNA纯化技术
作者: 来源: 2014-03-21

作分子生物学实验,核酸纯化、酶切、克隆算是最基本的步骤了.因为要做定向克隆,通常要作双酶切.为了省时省事儿,我们常常想方设法把两个酶放在一起切.可是事情并非总那么称心如意——两个酶经常在一起闹别扭,不是反应温度不同啦,就是Buffer不同,有时候两个酶切位点连在一起,必须先切一个再切另一个,否则就切不动——因为有的酶除了识别位点之外还需要旁边留有几个碱基,如果正好被切掉了就出问题.于是有人就到处找通用Buffer——其实所谓通用Buffer也只勉强适用于少数几个常用酶,而且往往会出现不是最佳反应条件的问题、星号活力问题——想想看,酶在生物体内精密调控各种反应,不是最适条件当然容易出问题——马虎一下有时就会有莫名其妙的结果,该切的切不动,不该切的切掉了,该连接的连不上,倒霉上一次就能浪费你几个月时间.于是我们一股脑的怨:酶有问题.可是如果两个酶分别切吧,费时间不说,切完一个,还要纯化好半天——就是不跑电泳也得酚氯仿抽提,本来就不多的样品这么一折腾,够呛.幸好如今有了试剂盒,一切都简单了.您别说,这试剂盒虽然花钱,原理也简单,可是用起来就是方便.第一次酶切后,只要5、6分钟可以很方便地快速纯化酶切样,不用酚抽不用乙醇沉淀,就可以进行第二次酶切,保证最佳反应条件,又何必煞费苦心的作双酶切呢,还可以减少一些人为的错误了.
    MinElute DNA纯化技术是基于一种特殊的、叫做Silica-gel-menbrane的膜,能够在高盐浓度的条件下迅速吸附DNA,在低盐或者纯水条件下释放DNA,只要短短几分钟,就能彻底除去包括引物、核苷酸、酶、矿物油、盐、琼脂糖、EB以及其它杂质,和以前QIAGEN的Silica-gel-menbrane有所不同的是,它要求的洗脱体积非常小,只要10微升,纯化的DNA是高度浓缩的,方便进行以后的反应.回收率在80%以上.
    反应步骤非常简单,只要将Binding Buffer加入酶切样、PCR产物或者切下来的凝胶条中充分混匀,加入柱中离心,洗涤,用10微升ddH2O或Elution Buffer洗脱即可.纯化的产物可用于连接、标记、测序、杂交、酶切、显微注射、体外转录等后继实验.由于洗脱体积小,无需进一步浓缩也能保证很高的回收率.比如双酶切,可以在第一次酶切后将酶切样直接纯化,留下1、2微升电泳检测,剩下的7、8微升样品全部进行下一个酶切,非常方便,不会浪费样品.不过它的吸附范围是70bp到4kb,而不是以往的10kb.4kb以上的只能用以前的Qiaquick系列了,而10kb以上就该用QIAEX II系列.和以往一样,MinElute系列也分为PCR回收试剂盒、胶回收试剂盒、反应产物回收试剂盒可供选择.
    记得一位回国访问的老师曾经说起,以前觉得美国学生笨,只会照着试剂盒123的作实验,没了说明书就不知如何是好,而中国学生聪明,能够灵活运用,可是如今发现中国学生有时太过灵活,省略不作对照、自作聪明地简化实验步骤,最后出了问题也找不到原因,反而不好.当时我们就说,没办法,都是没钱惹的祸,舍不得买试剂盒——能省就尽量将就一下,就是买了还要想办法节约一个对照,有时候就这么养成这种小家子气的习惯.回过头来想,真是:所谓“Research”就是要反反复复的“search”,不断失败,不断“search”,如果一下子就成功就不叫“Research”了,没有严谨良好的实验习惯就很难找到失败的原因,就很难做好Research.

相关阅读:
石蜡DNA提取
DNA片段回收与纯化
基因组DNA提取方法
外周血DNA提取技术
大白鼠肝DNA的提取与鉴定