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手把手带你迈过“细胞周期”流式检测的门槛
作者: 来源: PubmedPlus 2017-06-23

 

 

        开始讲周期检测前先带大家回忆一下细胞周期的基本知识(高手可自行跳过)。

        细胞周期(cell cycle)是指细胞从第一次分裂结束产生新细胞到第二次分裂结束所经历的全过程,分为分裂间期(interphase)有丝分裂期(mitosis)两个阶段。

        分裂间期分为三个连续的阶段:第一阶段称为 G1期,细胞对环境进行“监测",当接收到必要的信号后,细胞便开始合成 RNA和蛋白质来诱导细胞生长;一旦条件合适细胞便进入S期,开始合成 DNA和复制其染色体 DNA,使体细胞成为4倍体,与此同时还合成组蛋白,进行中心粒复制,S期一般需几个小时;最后在 G2期细胞持续生长并准备进行有丝分裂,中心粒已复制完毕,形成两个中心体,还合成RNA和微管蛋白等,G2期比较恒定,需用1~1.5小时。

        有丝分裂需经前期(prophase)、中期(metaphase)、后期(anaphase)和末期(telophase),是一个连续变化过程,由一个母细胞分裂成为两个子细胞。一般需1~2小时。

        此外还有G0期,G0期是细胞暂时离开细胞周期,停止细胞分裂,去执行一定生物学功能的细胞所处的时期。

 

        我们之所以能够对细胞周期进行检测主要就是根据周期不同阶段细胞DNA含量不同的原理进行检测,此外这个过程中一些蛋白的表达水平也会发生变化,亦可以成为周期检测的辅助手段。

 

1. 基本方法--单参数检测周期

        检测周期最简单、最基本的方法就是利用DNA染料,如PI、7-AAD等(各染料特征见文末附表)对细胞进行染色,DNA含量多则荧光强度高,DNA含量低则荧光强度低,根据荧光强度的变化就可判断细胞处在周期的哪个阶段。理想状态下,如果G0/G1期细胞的荧光强度为N,则S期细胞的荧光强度处于N~2N之间,G2/M期细胞的荧光强度为2N,如图示:

但实际情况则如下图所示:

        实际的图形中各期的细胞和理想情况相比都具有一定的宽度,这是由于细胞染色和激光照射不完全均一等原因所致,通常用变异系数(CV)来衡量,一般来讲CV值应该小于3%。这就带来了一个问题,图中红色圆圈部位的细胞到底处于哪个周期?解决方法是计算机上的周期分析软件可以利用数学模型通过一定的算法对结果进行分析,从而估算出各阶段的细胞比例。

 

下图为BD公司的Modfit软件分析得到的结果:

 

        如果上述方法得到的结果已经能够满足你的需要,请点击返回键退出阅读。但如果你有追求完美的处女座性格,并不满意计算机通过数学模型估算出的结果,请继续阅读周期检测的“进阶方法”。

 

进阶方法--双参数检测周期

        为了克服单参数法不能真实的反映出周期不同阶段细胞的比例这种困境,BrdU(5-溴脱氧尿嘧啶核苷),一种胸腺嘧啶核苷类似物,被引入了周期的检测方法中。BrdU能够在DNA合成期(S期)代替胸腺嘧啶(T),进入正在复制的DNA中,而后利用抗BrdU抗体便可对其进行检测,这样便可明确将S期细胞与G0/G1期细胞和G2/M期细胞进行区分。

 

        但BrdU需要变性DNA后才能与抗体结合,破坏了DNA双链结构,影响了Hochest等染色,导致染色弥散,准确性降低等问题,逐渐被EdU取代。EdU是另外一种胸腺嘧啶核苷类似物,在细胞内很容易扩散,无需DNA变性(酸解、热解、酶解等)即可有效检测,可有效避免样品损伤。


看似问题已经得到了解决,那么关于细胞周期检测我们还能做得更好吗?

        答案是肯定的。因为上述方法都不能对G0期和G1期的细胞进行区分,亦不能对G2期和M期的细胞进行区分。为了实现这个目标Christine Vignon等人发明了一种三参数双荧光的检测方案。除了常规的DNA染料7-AAD,研究人员引入了Ki-67和磷酸化组蛋白H3这两个指标,Ki-67在G0期不表达可以用来区分出G0期细胞,Ser10磷酸化的组蛋白H3与染色体凝缩高度相关可用来区分出处于M期的细胞。详情请见图:

 

        上述方法基本上可以满足大部分研究者对于周期研究的需求,至于对周期更极致的区分已经超出了小编的能力范畴,就不再献丑了。

 

 


 

双参数法都可以怎么玩?

        双参数法虽然对周期的区分不如三参数法细致,但根据不同的实验目的还是能够玩出一些不一样的感觉。

        如果你想知道在给定时间里有多少个细胞处于周期循环中,您可以将细胞暴露于BrdU下较短的时间(30分钟),然后进行检测。这样你就可以比较同种细胞接受不同处理方式后周期各个阶段细胞百分比的差异,或者比较不同细胞类型间的差异。

        如果你想知道培养的细胞中是否有静止的,未进入周期循环的细胞,可将细胞暴露于BrdU较长一段时间(例如24小时)后再进行检测。任何BrdU阴性的细胞都是未进入细胞周期循环的静止细胞。

        如果你对细胞跨越周期不同阶段所需时间感兴趣,您可以将BrdU添加到培养液中15分钟,然后换成不含BrdU的培养液。在不同时间点取样品进行检测。追踪实验开始时BrdU阳性的处于S期的细胞,比如当你看到标记的细胞重新出现在G1期,你就知道该细胞通过G2和有丝分裂期用了多长时间。

 


 

附:常用DNA染料及其特点