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指南|单克隆抗体生产的细胞工程学
作者:HTT 来源:生物制品圈 2017-05-17

 

1 导言

近年来,在临床试验中使用和批准用于治疗的单克隆抗体的数量大大增加,用于肿瘤治疗、自体免疫性疾病、过敏症、移植、抗独特型疫苗等。单抗生产的优化通常是通过尝试不同的生物反应器运行模型和工艺参数来完成,但实际上,宿主细胞类型、大小、周期、生产的特性、转染的载体/启动子,转染的方法、克隆选择、转录后调节、生长培养基等因素,对于最终的表达水平有重大的影响。因此,单克隆抗体生产的优化应该在过程的前几步就开始,而不仅仅在生物反应器中培养的过程。

 

2 表达系统

哺乳动物细胞是用于生产单抗在内的商业化治疗性蛋白产品的主要宿主细胞。而中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)是目前大规模生产单抗最常用的宿主细胞。CHO细胞在抗体的实验室制备以及工业级的生产中起着越来越重要的作用。CHO细胞产品具有以下特点:人体应用安全、糖结构与天然的人单克隆抗体相似、易于转染、基因扩增系统强大、易于适应悬浮培养和无血清培养基、高密度生长的能力,因此非常合适用于大量单克隆抗体稳定生产。

其他用于大规模生产的细胞为骨髓瘤细胞,如SP 2/0, YB 2/0, NS0 P3X63.Ag8.653 也能高密度生长、悬浮培养、无血清培养。这些细胞的使用频率低,但也有至少4个获得FDA批准的生物药物是用这些细胞生产的。杂交瘤细胞也广泛用于单克隆抗体生产,但他们对环境变化、细胞生长过程中会产生有毒的化学物质、生物反应器中剪切力和气泡的损害都比较敏感,这使得这些细胞的大规模培养变得复杂,使得这些细胞的使用减少。

人们逐渐对其他的单克隆抗体生产细胞株产生兴趣,如BHK细胞、HEK-293细胞以及人PER-C6细胞。最终表达量不仅与宿主细胞的特性相关,更是依赖于宿主细胞、表达载体、转染及挑选策略这些因素的组合。

 

3. 转染

转染包括一系列步骤:从表达载体的设计、转化方法的确定、表达系统和DNA传送系统到选择最适合的转染细胞。

 

3.1 表达载体

用于转入哺乳动物细胞的表达载体应该具有以下特征: 1)表达水平独立于在染色体中的整合位点;2)表达水平与整合基因的拷贝数及表达水平的维持有关。在哺乳动物细胞中的表达需要一个能驱使mRNA转录的启动子/增强子组合和一段能稳定或增强初级转录本翻译的序列组成的盒框。

对于在哺乳动物中表达重组抗体而言,通常采用已知对这个细胞株特别有效的启动子/增强子组合。最常使用的启动子/增强子组合来源于猴空炮 病毒(SV40)和巨细胞病毒(CMV)。来自SV40和牛生长激素基因的多聚腺苷酸化信号被认为可延长mRNA在细胞质中的半衰期并使其有效翻译,在哺乳动物表达盒框中最常用。 Kozak序列是围绕哺乳动物基因的起始密码子用于提高目的基因mRNA翻译起始的最佳的一致序列。

当用于构建稳定表达细胞株时,会加入一段标记基因。这通常会降低转染效率和存活细胞数,但这些存活的细胞拥有产生高质量重组蛋白的能力。

在转染以前可以将质粒线性化处理,另外,超螺旋的质粒进入细胞核后1-2小时内也会转化成线性结构。质粒DNA分子随机整合进入宿主基因组。

整合位点是影响转录率的主要因素,这一现象称为位置效应。质粒DNA在宿主细胞基因组中随机插入,根据整合位点,表达量可能高也可能低,甚至不表达,而重组的基因可能随着时间失去表达能力。为克服位置效应,人们已经开发出多种策略。例如,在载体两侧采用抗阻遏元件(如表达增强序列元件)、将载体特异地整合入开放染色体的位点或者使用核调控因子(核基质附着区或支架附着区)。

某些情况下,需要在调控诱导下表达产品,而不是稳定连续地表达。诱导表达系统包括热休克诱导表达、重金属诱导表达、糖皮质激素诱导表达。但因为这些诱导表达系统产生的效应影响范围广、本底表达高,研究者开发出Lac/IPTG、四环素、链霉阳素系统等。

单克隆抗体的重链和轻链需要按照最佳的理论配比比例表达。为此,采用了不同的载体设计策略。最常见的是为重链、轻链各设计一个载体, 共同转染进入宿主细胞。相对表达量的控制是通过转染细胞的载体量来进行的。因为整合位点的位置效应和细胞之间转染数量的不均衡,这种控制通常是最不准确的。将不同基因放在同一载体中,使用同样的启动子,可以准确控制表达基因之间的比例,但这会引入重组事件的风险。另一种策略是采用同一载体,重链、轻链各自使用不同的启动子。

 

 

3.2 转染方法

可以根据应用方式、经济的和技术的因素,选择使用不同的转染方法和转染系统,选择稳定转染或者瞬时转染。

 

3.2.1 稳转与瞬转

生产临床或商品化单抗通常使用稳转的方法,获得长期连续的表达。稳转通常加入标记基因以确定外源基因整合入宿主细胞染色体。稳转需要大量人力劳动、时间和仪器/资源的投入,因此需要更经济快捷的方式,如瞬转。瞬转与稳转过程相似,区别是不需要那些用来鉴定和选择在转染过程中质粒转入基因组的细胞的步骤。但瞬转的方式外源DNA在染色体外,其表达量少,还不适用于大量表达,但适用于高通量筛选过程、体内评估和早期的产品分析。

最常用的标记基因是二氢叶酸还原酶(DHFR)和谷氨酰胺合成酶(GS)。DHFR表达系统是基于编码DHFR酶的dhfr基因,通常用于CHO细胞。DHFR酶参与核苷酸代谢,催化二氢叶酸 转化四氢叶酸。转染成功的细胞获得了对遗传霉素(geneticin)的抗性。克隆筛选在缺乏hypoxanthine 和thymidine(H/T)和含遗传霉素的培养基中进行。另外,该筛选系统还可以通过增加MTX(一种DHFR抑制剂)提高选择压力,筛选获得目的基因扩增的克隆。GS筛选系统的原理是利用谷氨酰胺代谢:对于本身缺乏GS的细胞系,可以通过GS标记,在缺乏谷氨酰胺的本身培养基中进行选择筛选;而对于本身能够合成足够G的细胞系,可以采用类似DFHR的方法,加入能抑制内源性GS活性的抑制物MTS,这样只有那些转染了额外GS活性的细胞得以生存。

 

3.2.2.DNA 传送系统

DNA传送系统包括磷酸钙沉淀、电转、脂质体转染和多聚体转染。

磷酸钙沉淀最早被Graham 等在1973年提出,是应用最广泛的方法之一,主要基于DNA形成沉淀或复合物以內吞膜泡的方式进入哺乳动物细胞,该方法价格低廉且对多种细胞类型适用。 缺点是效率和可重现低。尽管有一些改进策略,如转染后加入DMSO、甘油或氯喹处理增加表达量,但转染效率仍然较低,且转染过程需要培养基中有血清,转染的结果非常依赖于操作过程中的微小变化。

电转是一种简单快速的转染方法,通过脉冲电场扰乱细胞质膜的电压差,形成可逆的小孔允许DNA进入细胞。运用该方法转染后细胞的生存率变低,通常用于需要快速和小量生产的小规模实验。

脂质体转染和多聚体转染可能是最简单的可用于多种细胞的方法。前与者在有或没有血清的情况下都可以使用,粘附细胞或悬浮细胞。后者可用于无血清的悬浮培养物种。

 

 

3.3 选择

转染后,通过标记基因来筛选能产生目标单抗的细胞,转入第二个培养容器中,放大培养。这些克隆根据细胞生长状况、单抗产物浓度。选出的细胞进行下一轮的培养和分析,来确认产量水平是否得以维持。最初选择的细胞克隆的产量可能不理想,可以通过增加选择压力(MTX, MTS)来增加拷贝数,进而提高表达水平和产量。

除了蛋白测定浓度外,在无血清培养基中形成克隆的能力、抗凋亡能力、细胞特征(细胞大小被认为是产量的主要细胞学影响因素)、适合的生产动力学、产物形成的稳定性、在压力和剪切力条件下细胞的健壮性,特别是生产过程中稳定地产生单抗的能力,这些因素对生产过程非常重要,也应当也包括在选择过程中。一般要求工作细胞库建库后至少60代的生产水平是稳定的。这在选择压力下是通常稳定的,但没有选择压力的情况下,就有不稳定的迹象。而选择压力的毒性会导致高成本、复杂的下游纯化工艺。因此在不使用这些选择有毒物质的同时保证稳定性变得非常重要。利用FHIS技术来研究整合位点是否属于已知的影响产品稳定性的位点,可能非常有用。这样可以排除那些不稳定表达的细胞, 不需要浪费时间对这些细胞进行很长时间的传代稳定性实验。

FACS被用于基于细胞特征的快速筛选,例如,Borth等开发的单细胞分泌实验可以测量单个细胞的分泌能力,然后使用流式细胞分选结合培养物条件,可以高效地选出想要的细胞,免去在筛选过程中进行生长相关的生产动力学研究。多参数FACS结合双色荧光报告基因的方法不需要重复的准备工作和繁重的工作流程,在12周内,经过1轮FACS,单抗产量提高38倍。

 

4 细胞工程学

近年来,人们通过抗凋亡、代谢工程、低温生长细胞工程、分子伴侣工程、翻译后加工这些策略来提高表达产量。

 

 

4.1 抗凋亡

由于细胞培养对环境敏感,而压力状态,如营养缺乏、停止提供生长因子、氧气有限、毒性代谢物积累、渗透压下降、剪切力水平过高,会诱导细胞凋亡,最终影响目标蛋白的产量。

非遗传方法是抗凋亡最容易实现的方法,包括增加周期性补充营养物质、使用半乳糖而不是葡萄糖 作为碳源、使用核苷酸,如腺苷酸。其他策略包括抗凋亡基因的过表达。已经测试的抗凋亡基因有Bcl-2, Bcl-xL,30Kc6, Aven, XIAP, CrmA和E1b-19K,这些基因同时还可以提高细胞密度和蛋白测定浓度。此外,可以使用抗凋亡的化学物质suramin,N-actylcsteine (NAC)等。caspase-3在细胞凋亡中起着重要作用,通过反义技术下调该蛋白的表达可用于抗凋亡。但这种效应只是一时的,因为当一个效应因子被下调时,细胞倾向于代偿性上调表达其他效应因子。另一种策略是通过抑制细胞周期进展,进而降低细胞死亡,增加细胞活率和蛋白表达量。

 

 

4.2 代谢工程学

代谢工程学是另一个遗传操作的关注点,通过抑制毒性副产物如乳酸和铵的积累来间接提高细胞生长和单位体积产率。常用两种途径:提高中心碳代谢的效率和降低乳糖积累。

 

 

4.3 细胞低温生长的工程学

27℃-32时,哺乳动物细胞单位生长速率较低,但细胞活率高,内源细胞蛋白污染少,低温培养条件也与细胞单位生产力有关。但是,低温条件下,单位体积产率却并不随着单位生产力增加而增加。事实上,研究中观察到细胞单位生长率与细胞单位生产力呈反比的关系。研究者们试图通过缓解低温对生长的抑制、下调低温诱导的RNA结合蛋白以促进低温下细胞的生长,采用这些方法,尽管细胞生长得到了提高,但单位体积产量没有提高。还需要继续研究低温下细胞生长缓慢的分子机制以便进行宿主细胞工程学研究。然而,高产量的细胞株由于额外代谢负担,生长相对缓慢。可选的一个策略是,先在细胞生长阶段采用37℃培养以获得高的细胞生长速率,然后在生产阶段转入低温培养得到高的单抗生产力,以获得高的单位体积产量。

 

 

4.4 分子伴侣工程

单抗是分泌型蛋白,许多研究表明,上调与蛋白分泌有关的内质网(ER)蛋白表达量与蛋白质高水平生产有密切关系。最常用的途径是ER分子伴侣的过表达,但可能产生不同的结果。例如,蛋白质二硫化物异构酶过表达在不同的实验中导致各不相同的结果:产量增加、减少甚至不影响。其他的分子伴侣包括重链结合蛋白(BiP)、ERp57、GRP94、内质网素。由于调控系统复杂,仅仅作用于分泌途径的一个部件也许并不是最好的方式,按照具有功能意义的比例的方式作用于多个分子伴侣、共分子伴侣、holdase和折叠酶可能是更好的策略。

 

 

4.5 翻译后加工工程学(糖基化)

糖基化变化可影响单抗在体内的性质和稳定性,是质量相关的属性之一。为了保证产品正确的糖基化水平,提高单抗的效应功能(如抗体依赖的细胞毒作用ADCC和补体依赖的细胞毒作用CDC),人们开展了许多许多糖基化工程研究,主要通过两种途径:糖转移酶的过表达和提高聚糖质量。前者比如,过表达半乳糖基转移酶、唾液酸转移酶、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶。后者的例子包括,将alpha-2,6唾液酸引入到CHO 和BHK细胞来帮助提高聚糖的质量和功能(这两种细胞缺乏相应的特异的唾液酸转移酶)。

 

5. 适应新的培养环境

生物药物产品的大规模生产工艺为悬浮和无血清培养基条件。因此,得到生产单抗的细胞后,需要适应这些新的条件。

 

 

5.1  悬浮培养

 悬浮培养是为了获得高的培养密度和产品量。由于天然状态下哺乳动物细胞是黏附生长的,悬浮生长需要一个适应过程。适应过程中有几个参数比较关键,如初始密度和活率。因为在适应过程中很高比例的细胞无法存活下来,就需要适当的高初始密度,需要在过程中监控细胞生长情况、活率和产量。通常加入稳定剂Fluronic F68保护细胞,减少剪切力对细胞的伤害。值得注意的是,加入任何的添加物都可能影响下游工艺,应谨慎分析。

 

 

5.2  无血清培养基

血清是培养基中支持细胞增殖重要的组分。但血清用于生产人的治疗药物有许多缺点:1)血清中各物质浓度的批间差异影响工艺一致性;2)给下游工艺带来负担;3)高成本;4)传播疾病的风险。因此,使用无血清培养基是商业化生产的目标之一。为了寻找能代替血清满足哺乳动物细胞生长的复杂营养需求的物质,人们进行了许多的努力,包括Ham’s方法(逐渐减少培养基中未定义的添加物)、Sato方法(重建与细胞生长相关的胞外环境)等,这些方法都比较耗时。细胞在无血清培养基中的适应通常通过两种途径实现:一步或逐渐降低培养基中的血清。不论哪种方式,细胞生长缓慢、活率低的状态都会维持好几代,需要定期监控。采用高的接种密度、更换培养基、维持足够的种子密度,可以一定程度上缩短这个过程。为使细胞容易适应,应减少选择压力,但为了保持基因的高表达水平,仍应该在过程中保留选择压力,尽管采用很低的浓度。

 

6. 结语

近年来,单抗在治疗应用中的重要性日益增加引起了大规模生产技术和策略的快速发展。为优化单抗生产而付出的努力仍在继续,但通常的关注焦点在于反应器设计和/或运行。然而,在反应器中培养之前的步骤,比如转染目的基因到宿主细胞、选择合适的克隆以及适应不同的培养条件,对后期表达水平有很大的影响。因此,优化工作应该从构建单抗生产细胞株的早期步骤就开始。另外,这些步骤非常耗时,对追求药品上市速度的生物制药企业来说,这是一个主要的缺点。而细胞工程学的研究很可能可以帮助人们跨过这个障碍。它可能实现研究者对细胞生长和生产效率更好的控制和提高细胞对新环境的适应力。但目前为止,某些结果还是互相矛盾的,这与对细胞的相关机理缺乏认识有关。在没有获知更多新的诀窍知识之前,成功将很大程度上依赖于试错实验,细胞工程学的进展将依赖于新的发现及其应用。

参考文献:

Rita Costa A, Elisa Rodrigues M, Henriques M, Azeredo J, Oliveira R.Guidelines to cell engineering for monoclonal antibody production.Eur J Pharm Biopharm. 2010 Feb;74(2):127-38.