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免疫磁性微珠分离法分离T淋巴细胞和B淋巴细胞
作者: 来源: 2014-07-15

  材料及试剂

  1. 磁性激活细胞分离器(MACS):MACS柱(C型,可结合2×108个细胞)生物素标记的抗CD4单抗和抗CD8单抗

  2. 生物素标记的羊抗鼠IgG F(Fab)2

  3. FITC标记的亲和素

  4. 生物素标记的磁性微珠

  5. MACS柱染色洗涤液、MACS柱洗脱液(含1%牛血清白蛋白的PBS)和MACS柱

  6. 浸湿液(含10%牛血清白蛋白的PBS)

  7. 人悬液或淋巴细胞悬液

  8. RPMI-1640细胞培养液

  操作方法

  1. MACS柱的准备新MACS柱需高压灭菌,60℃烘干后备用。使用前(至少2h前)应准备完毕。将2~3个C型MACS柱内分别用10ml注射器在柱下三通阀们处加入10mlMACS柱浸湿液,使液面达到柱内铁丝基质平面上2~3Cm处,关闭柱下三道阀们备用;

  2. 将人PBMC悬液或淋巴细胞悬液(含2×10 8  个细胞)离心,重新悬浮于0.15ml MACS染色洗涤液中,加入生物素标记的CD4单抗和抗CD8单抗各25ul(比例为0.05ug/10 6 个细胞),冰浴孵育25min。用MACS染色洗涤液洗涤2次后(1500r/min,5min),重新悬浮与0.15ml MACS染色洗涤液中,加入50ul生物素标记的羊抗鼠IgG F(Fab) 2 (比例为0.05ug/10 6 个细胞),冰浴孵育25min。用MACS染色洗涤液洗涤2次后(1500r/min,5min),重新悬浮与0.15ml MACS染色洗涤液中,加入50ul FITC标记的亲和素(比例为0.08ug/10 6 个细胞),冰浴孵育15min。用MACS染色洗涤液洗涤2次后(1500r/min,5min),重新悬浮与0.15ml MACS染色洗涤液中,加入生物素标记的磁性微珠(比例为5ul/10 8 个细胞),冰浴孵育5~10min。在加入3ml MACS柱洗脱液;

  3. 将MACS柱放入MACS磁铁槽内,用20ml MACS柱洗脱液洗柱,待液体降至柱内铁丝基质平面上2~3处,关闭三通阀们。将细胞悬液置于MACS柱内。在柱下放一支50ml的试管,打开阀们,使其流速为3~5ml/min,边流边加MACS柱洗脱液,每个柱内至少加柱洗脱液30ml。试管内的洗脱液中为CD4-CD8-细胞(即阴性分离)。离心洗涤后调整细胞至所需浓度备用;

  4. 将MACS柱移出磁场外,用MACS柱洗脱液洗柱(较大流速),则该洗脱液中为CD4+、CD8+或CD4+CD8+细胞(即阳性分离)。离心洗涤后调整细胞至所需浓度备用;

  5. 再用另外两个MACS柱重复上述过柱过程,以提高细胞分离纯度;

  6. 结果评价:分别取上述两种细胞悬液个0.5ml,在流式细胞仪(FCM)上进行测定分析,FITC阴性细胞(阴性分离细胞)为CD4-、CD8-细胞,而FITC阳性细胞(阳性分离细胞)为CD4+、CD8+或细胞CD4+CD8+细胞。如果FITC阴性细胞中FITC阳性细胞率高于5%~10%,则需重复进行MACS分离过程。MACS分离细胞具有高纯度(一般为95%~99%)等特点。其分离效果与流式细胞仪的细胞分离效果相媲美,并具有比流式细胞仪分离术经济、省事节时、操作简单、快速等优点。

  注意事项

  1. MACS柱用毕后需立即用双蒸水冲洗干净(或用同等柱体积量的PBS洗涤20次),再以20倍于柱体积的无菌双蒸水和5倍于柱体积的95%乙醇溶液洗涤,37℃下烘干,高压灭菌备用。

  2. 有各种不同容量的MACS柱,可根据需要选择。

  3. 不要将组织块或大细胞团块加入柱内,以免造成堵塞进而毁坏MACS柱。

  4. 洗脱MACS柱时,流速越慢则分离细胞的纯度越高。为了获得高纯度的阴性分离的细胞群体或除去某种细胞,可重复过柱3次,第一次过柱时流速可快些(6ml/min)。如果仅为了获得阳性细胞,则流速可少快(3.5~5ml/min)。

  5. 在MACS柱上加入液体时不要产生气泡。

  6. 在分离洗脱时,柱内液体不要低于柱内的铁丝基质平面以下,即始终让铁丝基质内含有液体,否则细胞分离将完全失败。

  7. 如果分选的细胞还需要进行培养,所有的器材和液体均应无菌。MACS分离过程应在超净工作台内完成操作。

  8. 用作细胞功能实验时,最好用免疫磁性微珠阴性分离细胞,因为这些细胞未发生抗原抗体反应而基本上处于正常状态;而免疫磁性微珠阳性分离细胞,由于发生抗原抗体结合反应,可能导致细胞活化或凋亡,从而使细胞处于非正常状态,影响到细胞的功能状态。因此用免疫磁性微珠阳性分离细胞作功能实验时应十分谨慎。