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Percoll密度梯度离心法分离嗜碱性粒细胞
作者: 来源: 2014-07-15

  正常人血液中,嗜碱性粒细胞是数量最少的一种白细胞(2.8×104/ml),因此也是最难分离、提纯的一种细胞。目前仍然用密度梯度离心法分离嗜碱性粒细胞。

  试剂及配制

  1. 无Ca2+ 、Mg2+ Hank’s液

  2. Percoll混悬液:取购买的Percoll(Pharmacia)90ml,HBSS 9ml,HEPES(0.25mol/L,pH7.3)1ml,HCl(1mol/L)0.4ml混合,调节pH7.4。

  3. Percoll密度梯度离心管配制:

  A液:Percoll 混悬液23.0ml,加HBSS 10.0ml(比重1.088)

  B液:Percoll混悬液27.0ml,加HBSS 15.9ml(比重 1.079)

  C液:Percoll混悬液 24.0ml,加HBSS 20.0ml(比重1.070)

  在离心管中依次加入4ml A液、4ml B液、3mlC 液,制成3个密度梯度(上述分层液在临用前配制,同时应小心,不使各层混合)。

  操作方法

  1. 将新鲜的抗凝血(用0.1mol/L ,pH7.7 EDTA抗凝)按等体积加于Percoll密度梯度分层液上,室温下离心,1200r/min,25min;

  2. 将每一层细胞分别吸出,各放入1只试管内,加无Ca2+ 、Mg2+ Hank’s液在4℃下洗涤3次,每次1200r/min离心10min,弃上清;

  3. 将分别得到的各层细胞涂片,固定后用Wright-Giemsa 染液染色。在显微镜下检查嗜碱性粒细胞(大多数嗜碱性粒细胞在中间层,但不同个体嗜碱性粒细胞的比重不同,因此可能会出现在其他细胞层)。嗜碱性粒细胞染成暗紫红色。

  ** 用此法分离的嗜碱性粒细胞中含淋巴细胞数量小于2%,不含红细胞。方法简便,重复性好。