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不连续密度梯度分离法分离NK细胞
作者: 来源: 2014-07-15

  PNK细胞即自然杀伤细胞,是一群具有自然杀伤能力的大颗粒淋巴细胞,无粘附作用。它们不需要抗原激活,也没有MHC限制性,即能直接杀伤肿瘤细胞。成熟的NK细胞离开骨髓进入外周免疫器官,主要分布在脾脏和外周血中,约占外周血的3%。

  试剂及配制

  1. pH 7.3柠檬酸缓冲液:柠檬酸 327mg;柠檬酸钠 2.63g;碳酸氢钠 222mg;葡萄糖 2.55mg;蒸馏水加到 100ml

  2. 聚蔗糖-泛影葡胺分层液(D=1.077±0.001)

  3. Percoll(Pharmacia)产品

  4. Hank’s液(含5%小牛血清)

  操作方法

  1. 外周血单个核细胞的分离

  ①将外周抗凝血与柠檬酸缓冲液按7:1比例混合;

  ②离心,1000r/min,10min,弃上清,注意勿触及细胞沉淀;

  ③用吸管小心吸取细胞沉淀上面富含白细胞的部分;

  ④以3倍体积的Hank’s液稀释细胞,置于聚蔗糖-泛影葡胺分层液上,离心,2000r/min,20min;

  ⑤小心吸取界面白细胞部分,用Hank液洗2次,配成0.5~1×108/ml。

  2. 非连续Percoll密度梯度离心

  ①将Percoll渗透压调整到285mOsmol/kgH2O;

  ②制备7种不同的Percoll分层液,范围为40%~57.5%,每梯度相差2.5%,即40%、42.5%、45%、47.5%、50%、52.5%、55%、57.5%;

  ③将不同梯度的Percoll轻轻地一层层铺起,从高度密度至低密度加,最后加1ml细胞悬液于顶部;

  ④离心,2000r/min,30min;

  ⑤小心地吸取第二、三部分的细胞。第一部分是顶部液体与40% Percoll之间,第二部分是40%与42.5%Percoll之间,第三部分是42.5%与45%的Percoll之间,这两部分富含NK细胞;

  ⑥用Hank’s液洗2次,1000r/min,10min,细胞重悬于Hank液中,4℃存放备用。

  结果观察

  通过形态学分析,Percoll密度梯度离心分离的NK细胞80%为大颗粒淋巴细胞,细胞活力95%。

  鉴定

  CD56、CD57单抗间接免疫荧光发鉴定纯度,台盼蓝拒染法测存活率。

  注意事项

  1. 血标本应新鲜,宜在4℃下分离细胞,以保持细胞活力。

  2. 一般用柠檬酸盐抗凝,可能柠檬酸盐能更有效阻断补体系统在体外活化。