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磁化细胞分离器分离法(MACS)分离NK细胞
作者: 来源: 2014-07-15

  从外周血分离单个核细胞,以粘附法除去其中的单核细胞后,以尼龙棉柱法除去其中的B细胞,余下的T细胞和NK细胞以磁化细胞分离器(MACS)进行分离。有两种方法:阴性选择法,在反应中加入抗CD3抗体,使T细胞与之特异结合后形式磁性分离柱内,以除去标记的T细胞,洗下的未标记细胞;阳性选择法,在反应中加入抗CD16及抗CD56,使NK细胞与之特异结合形成磁性免疫复合物留于柱内,将未标记细胞洗去后,将标记的NK细胞以洗液轻轻加压洗脱。

  试剂及配制

  1. 含10%血清PRMI-1640液

  2. 含1%小牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(1% BSA/PBS):作为抗体稀释液和洗涤液。

  3. 抗 CD3单克隆抗体

  4. 抗CD16单克隆抗体:CD16为人NK细胞表面的一种分化抗原。

  5. 抗CD56单克隆抗体:CD56亦为人NK细胞表面的一种分化抗原。

  6. 生物素标记的羊抗鼠血清

  7. 异硫氰酸荧光素(FITC)标记的链霉亲和素

  8. 生物素标记的磁球颗粒

  操作方法

  1. 分离外周血单个核细胞(PBMC):见聚蔗糖-泛影葡胺分离法。

  2. 将单个核细胞的浓度用含10%血清RPMI-1640调整为4×106 /ml,加入到无菌的塑料平皿中,37℃,7.5%CO2 环境中培养2h后,除去粘附于塑料的单核细胞和B细胞;

  3. 非粘附细胞与含10%血清RPMI-1640液预孵育1h后过尼龙棉柱,B细胞和剩余的单核细胞粘附在尼龙棉柱上,用培养液洗柱,收集洗下的T细胞和NK细胞;

  4. 用磁场分离T细胞和NK细胞:以无菌操作标记和分离细胞。新分离的T细胞和NK细胞在水浴中进行标记,细胞先与抗表面抗原的单抗孵育10min(107 个细胞用100ul抗CD3单抗或25ul抗CD16单抗或抗CD56单抗),细胞经洗涤后与生物素标记的100ul羊抗鼠抗血清孵育10min,洗涤后加入FITC标记的链霉亲和素25ul,反应8min,洗涤后加生物素标记的磁颗粒(加抗CD3单抗者加100ul磁颗粒,加25ul抗CD16单抗或抗CD56单抗者加50ul磁颗粒)反应8min。上述每步反应后,均以10倍体积的含1%牛血清白蛋白的PBS洗涤,3000r/min离心8min,以终止反应。使用磁化细胞分离器(MACS)作免疫磁性分离。分离柱在使用前以高压灭菌。

  5. 将标记有磁性复合物的细胞悬液重悬于2~5ml含1%牛血清白蛋白的PBS中,调其细胞浓度为5×107 ~1×108细胞/ml。将分离柱先与含1%牛血清白蛋白的PBS预孵育30min,4℃预冷后放入永久性磁铁的磁场中,将标记细胞悬液加80~100ml。将分离柱拿出磁场,用50ml洗液在无菌条件下以注射器轻轻加压洗脱标记的细胞,离心沉淀细胞,用荧光显微镜分析,用台盼蓝估计存活率,以RPMI-1640液保存。

  注意事项

  NK细胞为CD16+、CD56+、CD3-细胞。若反应中加入了抗CD3单抗,则洗脱的未标记细胞为NK细胞;约反应中加入了抗CD16、抗CD56单抗,则柱中保留的标记细胞为NK细胞。前一种方法为阴性选择法,后一种方法为阳性选择法。