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PriCells: 磁珠法分离小鼠T细胞和B细胞
作者: 来源: 2014-07-15

  基本方案

  用AUTOMACS系统进行总T细胞、CD4+ 细胞或CD8+ T细胞的自动分离

  实验材料

  1、小鼠

  2、HBSS洗涤缓冲液

  3、MACS缓冲液

  4、磁珠

  5、RPMI-10完全培养基

  6、AUTOMACS系统和分选柱

  7、30μm尼龙网或40μm预分离滤膜

  实验方法

  1、用5只小鼠的淋巴结或2只小鼠的脾脏制备单细胞悬液并去除红细胞。

  2、细胞在10mlHBSS洗涤缓冲液中混悬后用血细胞计数器计数。

  3、细胞悬液在4℃,200g离心10min。弃上清后将沉淀按每108 个细胞0.9ml MACS缓冲液的比例混悬。每108个细胞加入0.1ml适当的磁珠后在4℃孵育15min。

  4、在孵育的时间里,打开AUTOMACS系统电源。按产品说明书中操作规程运行清洁程序。

  5、细胞悬液在4℃,200g离心10min。弃上清,在沉淀中加入足量的MACS缓冲液使细胞浓度达到108 个细胞/ml,充分混悬。将细胞通过30μm尼龙网或40μm预分离滤膜。用0.1~0.4mlMACS缓冲液冲洗滤网。

  6、细胞放到AUTOMACS的上样通道。选择possel程序,这样标记的细胞将从阳性通道洗脱。

  7、细胞悬液在4℃,200g离心10min。弃上清后将沉淀用2~5ml RPMI-10完全培养基混悬。计数。

  附录:

  RPMI完全培养基:

  RPMI1640培养基含有:

  2%、5%、10%、15%或20%FBS,56℃热灭活1h

  2μmmol/L L-谷氨酰胺

  50μmol/ml 2-ME

  100U/ml 青霉素

  100μg/ml 硫酸链霉素

  RPMI-10完全培养基:

  配制RPMI完全培养基加入:

  10%(V/V)FBS

  1mmol/L 丙酮酸钠

  50μg/ml庆大霉素

  10mmol/L HEPES

  4℃可保存2周

  过滤除菌

  HBSS洗涤缓冲液:

  HBSS,含有:

  5%(V/V)FBS

  20mmol/L HEPES,pH7.0

  100U/ml 青霉素

  100μg/ml 链霉素

  4℃可保存1个月

  MACS缓冲液:

  PBS,pH7.2

  0.5%(m/V)BSA

  2mmol/L EDTA

  过滤除菌

  用于自动MACS系统,室温储存1个月

  用于LS或LD柱时,脱气,4℃保存