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原代细胞DNA与RNA的吖啶橙荧光染色法
作者: 来源: 2014-07-15

  基本原理:

  吖啶橙(acridine orange,AO)是一种常用荧光染料,吖啶橙与原代细胞内的DNA、RNA都有亲和力,但有一定的特异性,即结合后发不同颜色的荧光,DNA呈亮绿色,而RNA呈橘红色至火红色。此法简便快捷,既可染活原代细胞又可染固定原代细胞。用于直接染色观察活原代细胞或固定染色观察原代细胞均可。吖啶橙对活原代细胞毒性小,配成1×10 -4 —2×10 -4 可用于直接染色活原代细胞和进行荧光显微镜观察,但不持久,用固定染色观察法效果更好。

  材料:

  1. 盖片单层培养原代细胞;

  2. 固定剂:95%乙醇或乙酸/甲醇(现配);

  3. 吖啶橙:用生理盐水配成1%的干液。使用时再用PBS稀释成1×10 -4 —2×10 -4 mol/L pH4.5—5.0的染色液;

  4. 0.1mol/L的CaCl2 ;

  5. 1%乙酸;

  染色步骤:

  1. 将盖片单层培养原代细胞从瓶中取出,立即用温Hanks液漂洗3—5s,以去除培养基中血清;

  2. 投入95%乙醇或乙酸/甲醇固定15—30min,用滤纸接触盖片边缘,盖片微干;

  3. 用1%乙酸酸化30s;

  4. 用1×10-4 —2×10-4的吖啶橙染液染色30s或1min;

  5. 用0.1mol/L的CaCl2 处理30s—2min;

  6. PBS漂洗3次,每次数秒;

  7. PBS封片,荧光显微镜下直接观察并拍照;

  8. 注意事项:观察中应随时填加PBS以避免标本干涸。如用油浸镜观察,需再覆以大盖片盖在附有原代细胞盖片上,保证原代细胞面朝上,用无荧光性油浸镜观察。原代细胞盖片标本在95%乙醇中能保存数日后仍可观察,如退色,再用AO染色。镜下观察,DNA呈翠绿色,RNA呈火红色。

  结果:

  原代细胞核因含DNA呈绿色,细胞质及核仁因含RNA呈红色;