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正常人包皮成纤维细胞的培养
作者: 来源: 2014-07-15

  实验材料:

  1. 细胞来源:新生儿包皮;

  2. 不含Ca2+ 和Mg 2+ 的1×PBS,添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素,pH7.2;

  3. 0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液:两者比例为1:1,用D-Hanks液配制;

  4. 0.02%大豆胰蛋白酶抑制剂:用DMEM培养液配制;

  5. 生长基质:人纤维连接蛋白,按10μg/cm 2 包被培养皿;

  6. DMEM培养液:DMEM培养基,加10%胎牛血清、青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml;

  7. DMF培养液:为无血清化学限定性培养液。基础培养基为1:1的DMEM和Ham F12混合培养基,加入EGF100ng/ml、胰岛素100 ng/ml、转帖蛋白μg/ml、凝血酶1μg/ml、抗坏血酸10μg/ml、氢化可的松5×10-5mol/ml、卵清蛋白1mg/ml和微量元素。添加青霉素100 IU/ml、链霉素100μg/ml;

  8. 无菌消毒手术器械、35mm培养皿、三角瓶、100目网筛;

  9. 离心管(15ml、50ml)

  实验方法:

  1. 分离表皮和真皮;

  ① 在无菌条件下取新生儿包皮,用生理盐水洗净皮片上的血迹;

  ② 将皮片放入盛有0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液的三角瓶中,密封后存放于4℃冰箱中18h;

  ③ 转移皮片至培养皿中,小心分离表皮层并弃之;

  ④ 用DMEM清洗真皮片,备用;

  2. 制备细胞悬液;

  ① 充分剪碎真皮片,加入胶原酶溶液,于37℃孵育1h;

  ② 用吸管反复吹打组织块,分散细胞;

  ③ 经100目筛网过滤消化液,收集滤过的细胞悬液;

  ④ 离心细胞悬液(800r/min,5min),弃上清液;

  ⑤ 用DMEM培养液将沉淀的细胞团制成细胞悬液;

  ⑥ 细胞计数,调整细胞密度;

  3. 有血清培养:原代细胞和传代后的1—3代细胞用10%胎牛血清的DMEM培养液维持培养;

  ① 以5×10 -5 个/ml的密度将细胞接种于培养瓶中。于37℃、5%CO 2 培养箱内培养。每2—3d换液一次;

  ② 原代培养至成纤维细胞汇合成单层后,按常规方法传代;

  4. 无血清培养:用DMF培养液支持已建立细胞系的包皮成纤维细胞的生长和增长;

  ① 取在含血清条件下已生长汇合成片的培养物,弃培养液。用PBS清洗3次,尽量除去残留血清;

  ② 用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液消化分散细胞。在镜下观察到细胞变圆后,加入大豆胰蛋白酶抑制剂终止消化;

  ③ 加入DMF培养液,用吸管吹打分散细胞。调整细胞密度;

  ④ 取已包被人纤维连接蛋白的35mm培养皿,每皿接种5×10 4 个细胞。于37℃、5%CO2 的培养箱内培养。每2—3d换液一次;

  ⑤ 细胞长满基质表面后,按常规方法传代。