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正常大兔脑微血管内皮细胞的培养
作者: 来源: 2014-07-15

  实验材料:

  1. 正常兔大脑皮质组织;

  2. 不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS,添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素,pH7.2;

  3. M199培养液(含20%小牛血清、肝素25U/ml、HEPES 10mmol/L、100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素);D-Hanks液;0.05%胰蛋白酶溶液;0.05%胶原酶溶液;15%右旋糖苷(用Hanks配制,pH7.4);

  4. 匀浆器、手术刀、解剖剪、解剖镊、眼科剪,眼科镊,止血钳,无菌消毒手术器械;

  5. 离心管(15ml、50ml)

  6. 网筛:110μm尼龙网筛

  实验方法:

  1. 通过颈动脉放血将兔处死,去头皮。将头颅取出并浸入75%的乙醇中,消毒约1min。在无菌状态下迅速取出兔大脑皮质。需小心剔除大血管和软脑膜;

  2. 将脑皮质放入D-Hanks液中,漂洗数次后,将其剪碎。再移入含0.05%胰蛋白酶溶液的小瓶内,在37℃水浴中消化10—20min;

  3. 用有血清培养液中止消化。置于玻璃研磨器内研磨,制成粗悬液。经孔径为110μm尼龙筛网过滤,将滤液以4000r/min离心10min;

  4. 弃离心后的上清液。给沉淀加入15%右旋糖苷溶液,重新悬浮沉淀。然后,再以4000r/min离心20min。收集微血管片段;

  5. 用0.05%胶原酶溶液消化2—4h。用Hanks液洗涤并离心,给微血管片段加入M199培养液;

  6. 接种到培养瓶中,置37℃、5%CO2 的培养箱中(湿度100%)培养

  7. 24h后换液,将未贴壁的微血管段移入其它培养瓶或皿中继续贴壁生长。之后,每3d换液一次,待细胞长至融合状态时,即可进行传代培养。