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动物肠黏膜上皮细胞的培养
作者: 来源: 2014-07-15

  实验材料:

  1.  动物胎体小肠黏膜或死亡胎儿的小肠黏膜

  2.  1%Ⅳ胶原蛋白铺培养瓶,放超净工作台上干燥

  3.  不含Ca2+ 和Mg 2 + 的1×PBS,添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素和200000U/L庆大霉素,pH7.4

  4.  300000U/LⅪ型胶原酶和0.1g/LⅠ型中性蛋白酶混合消化液,DMEM配置

  5.  解剖剪、解剖镊、眼科剪,眼科镊

  6.  离心管(15ml、50ml)

  实验方法:

  1.  取妊娠17-19d胎鼠,放入70%乙醇中消毒1min。经腹正中切口取出小肠,放入预冷的PBS中。

  2.  用PBS冲洗后,剪除肠系膜。纵行剪开肠壁,用PBS冲洗3次,洗去粘液。

  3.  将肠壁剪成1mm 3 左右的小块的组织块,放入20ml消化液中,37℃水浴中振荡消化30min。

  4.  用吸管反复吹打组织块3-5min,然后以1000r/min,离心5min。吸去消化液后,加入PBS,反复吹打,悬浮沉淀的肠绒毛组织。在相差显微镜下观察可见单个黏膜上皮细胞或隐窝细胞团。

  5.  将消化下来的细胞或细胞团加入分离管中,再加入分散液,吹打均匀,静置1min。然后,收集含细胞或细胞团的上清液。重复3-4次。

  6.  将收集的上清液离心(1500r/min,5min)。用分散液将单个细胞和肠隐窝细胞团混悬,离心(1500r/min,5min),重复3-4次。

  7.  用培养液混悬沉淀细胞,将细胞悬液加入培养皿或培养瓶中,放入37℃,含5%CO2 的孵箱中培养。

  8.  48h后换培养液,以后每隔2-3d换液1次。