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正常人关节软骨细胞的长期培养
作者: 来源: 2014-07-15

  实验材料:

  1. 软骨细胞来源:20—24周自然流产胎儿的股骨和胫骨;

  2. 清洗液:不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS,添加100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素,pH7.2;

  3. 消化液Ⅰ:2mg/ml胰蛋白酶和2mg/ml胶原酶混合消化液,用PBS液配制;

  4. 消化液Ⅱ:0.5mg/ml胶原酶,用培养液Ⅰ配制;

  5. 培养液Ⅰ:DMEM培养液,补充10%胎牛血清;

  6. 培养液Ⅱ:DMEM培养液中补加10%胎牛血清、青霉素1000IU/ml、链霉素1mg/ml、两性霉素2.5μg/ml、谷氨酰胺2mmol/L、1%维生素添加剂(vitamin supplements)以及维生素C 50μg/ml;

  7. 10% poly HEMA:称取6g多聚2-羟乙基甲基丙烯酸酯(2-hydroxyethylmethacrylate,poly HEMA),加到50ml 95%乙醇中,于37℃恒温振荡水浴箱中缓慢振荡过夜,次日将所得溶液离心(2500r/min,10min),除去未溶解的颗粒,此为干液。取1ml干液与9ml 95%乙醇混合,稀释成10%(V/V)的poly HEMA溶液;

  8. 筛网:孔径为100μm的尼龙筛网。

  实验方法:

  1. 在无菌条件下,从20—24周自然流产胎儿的股骨头和胫骨坪切取骺软骨。用PBS液洗净血液。尽量除去纤维性组织;

  2. 将软骨放入消化液Ⅰ中,于37℃孵育1h;

  3. 弃孵育液。将软骨块充分切碎,加入消化液Ⅱ,在37℃孵育过夜;

  4. 用尼龙筛网过滤,滤液中加入培养液Ⅰ。再经250g离心5min,弃上清液;

  5. 用培养液Ⅰ将细胞团吹散,重新悬浮细胞,离心。重复4次。用培养液将最后得到的细胞团制成悬液;

  6. 计数细胞。从每克软骨平均可获得大约3.0×108 个软骨细胞;

  7. 取0.9ml 10% poly HEMA溶液铺在直径为60mm的塑料培养皿内,水平放置在通风的超净工作台上干燥(过夜);

  8. 使用前将包被poly HEMA的培养皿用灭菌紫外灯照射30min;

  9.  将含5×106 个软骨细胞的悬液接种到已包被poly HEMA的培养皿中,在37℃、5%CO2 、饱和湿度的CO2 培养箱中培养;

  10. 每3—4d换一次液。培养可持续半年以上。