您现在在位置: » 内容
GST融合蛋白纯化常见问题指南
作者: 来源: 2014-07-10

  导读:在GST融合蛋白纯化中,经常会遇到一些问题。本专题对这些问题进行了汇总,指出了大多数纯化方法存在的普遍问题,对于特别的纯化方法的问题也有提,形成了GST融合蛋白纯化常见问题指南。

  谷胱甘肽S转移酶(GST)是一个含有211个氨基酸的蛋白,通常将该蛋白加入到重组蛋白的末端以便对该重组蛋白进行纯化或检测。具有组氨酸的非融合蛋白会产生非特异性结合,这会阻碍组氨酸标签的亲和纯化。但GST标签则与之不同。由于GST对于其底物-谷胱甘肽具有极高的特异性,所以可以获得更高的纯度。

  另外,GST标签蛋白含有特殊的剪切序列,纯化后使用不同的蛋白酶即可简单的去掉GST标签。同时,GST标签蛋白的纯化在非常温和的条件下进行,可有效保护靶蛋白的功能和抗原性。

  但是,在GST融合蛋白纯化中,经常会遇到一些问题。本专题对这些问题进行了汇总,指出了大多数纯化方法存在的普遍问题,对于特别的纯化方法的问题也有提,形成了GST融合蛋白纯化常见问题指南。

  问题一:目的蛋白与磁珠不结合或结合效率低 

  

 

  可能原因:目的蛋白与磁珠不结合或结合效率低

  解决办法:测序确认,调整阅读框以获得GST.Tag融合表达蛋白;使用蛋白酶缺陷型大肠杆菌作为表达宿主菌;如果有稀有密码子应采用Rosetta系列宿主菌。

  可能原因:GST 融合蛋白被机械裂解的方法变性(比如超声)

  解决办法:过度超声会破坏标签蛋白而减少其与磁珠的结合;在裂解过程中,用温和的机械/化学裂解条件,裂解的条件必须依照经验来决定。

  可能原因:GST 融合蛋白在样品中有聚集,导致沉淀

  解决办法:在细胞裂解前加入DTT,在缓冲液中也加入DTT 。1-20mM的DTT 会显著增加某些GST融合蛋白的结合。

  可能原因:GST融合蛋白的浓度过低

  解决办法:浓缩样品。结合能力具有浓度依赖性。低表达量的蛋白可能不会像高表达量蛋白那样有效地结合磁珠。因此,浓缩样品会提高结合。

  可能原因:标签蛋白可能改变了GST 的构象,因此降低了GST 标签蛋白的结合能力。

  解决办法:检测所使用的pGEX 载体中GST的结合。准备带有所使用的pGEX的细胞超声裂解物,检测其与磁珠的结合。如果结合的很好,则可能是标签蛋白改变了GST 的构象,因此降低了GST 标签蛋白的亲和力。可以通过降低结合的温度到4°C限制洗涤来改善结果。

  可能原因:结合条件不佳

  解决办法:低于pH6.5或高于pH8时,融合蛋白与磁珠结合不充分导致结合效率低,请确认磁珠在用于目的蛋白纯化前经过pH6.5~8.0缓冲液充分的平衡。

  可能原因:磁珠使用次数过多

  解决办法:如果已使用几次,应考虑磁珠再生或使用新的磁珠。

  问题二:目的蛋白不能洗脱或洗脱效率低 

  

 

  可能原因:洗脱缓冲液的体积太少

  解决办法:增加洗脱缓冲液的体积。

  可能原因:洗脱的时间不够

  解决办法:增加洗脱缓冲液与磁珠反应的时间。

  可能原因:洗脱缓冲液中谷胱甘肽浓度太低

  解决办法:增加洗脱缓冲液中谷胱甘肽的浓度:本方案中建议的10mM 浓度对于大多数应用来说足够了,但是也存在例外。尝试使用50mM Tris-HCl,20-40mM 还原型谷胱甘肽,pH8.0 作为洗脱缓冲液。

  可能原因:洗脱缓冲液的pH过低

  解决办法:增加洗脱缓冲液的pH值:将pH增加到8-9 会增强洗脱而不用提高洗脱所用谷胱甘肽的浓度。

  可能原因:洗脱缓冲液的离子强度过低

  解决办法:增加洗脱缓冲液中的离子强度,在洗脱缓冲液中加入0.1~0.2M的氯化钠也会改善洗脱效果。

  可能原因:洗脱缓冲液中的谷胱甘肽被氧化了

  解决办法:使用新鲜配制的洗脱缓冲液。

  可能原因:非特异的疏水相互作用导致蛋白和磁珠非特异的结合或聚集,从而阻止了标签蛋白的溶解和洗脱。

  可能原因:非特异的疏水相互作用导致蛋白和磁珠非特异的结合或聚集,从而阻止了标签蛋白的溶解和洗脱。

  问题三:洗脱的蛋白中有杂质 

  

 

  可能原因:GST融合蛋白被蛋白酶部分降解

  解决办法:加入蛋白酶抑制剂。出现多条带可能是由于目的蛋白被蛋白酶部分降解的结果。可在裂解溶液中加入1mM PMSF防止目的蛋白降解。一种无毒的水溶性的PMSF替代物是AEBSF,Roche Biochemicals的商品名为Pefabloc SC 。注:丝氨酸蛋白酶抑制剂必须在使用凝血酶或凝血因子Xa 前除去。

  可能原因:在宿主细菌中的蛋白降解

  解决办法:多条带可能是在宿主细菌中蛋白酶切造成的。如果是这种情况,需要使用蛋白酶缺陷型菌株(比如lon-或ompT),大肠杆菌BL21 随pGEX 载体提供,这种菌株是ompT和lon缺陷型菌株。

  可能原因:细胞破碎时超声处理过度

  解决办法:降低裂解时间,机械裂解前加入溶菌酶(0.1 倍体积的10 毫克/毫升溶菌酶溶液,溶菌酶保存在25mM Tris-HCl,pH8.0 )可能会使结果变好。避免发泡,因为这可能使标签蛋白变性。过分裂解也会导致宿主细胞蛋白和GST 标签蛋白共纯化。

  可能原因:分子伴侣可能被共纯化了

  解决办法:多余的条带可能由于共纯化一些分子伴侣所造成。这些分子伴侣参与大肠杆菌中新生成的蛋白的正确折叠。如:DnaK(分子量70 000)、DnaJ(分子量37 000)、GrpE(分子量40 000)GroEL (分子量57 000)、GroES(分子量10 000 )。一些从这些共纯化的蛋白中分离GST融合蛋白的方法已经发表。

  问题四:目的蛋白酶切后电泳检测发现多条条带 

  

 

  可能原因:蛋白酶切发生在宿主细菌内

  解决办法:检测条带何时出现:如果确定多余的条带在Precission Protease,凝血酶,凝血因子Xa切割前不存在,这些条带可能是在宿主细菌中被降解的结果。目的蛋白可能含有Precission Protease,凝血酶,凝血因子Xa 的切割位点,请检查序列。